薛迪 劉宇超 賈永明 汪娜 劉學(xué)偉

摘 要 目的：基于磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/糖原合成激酶3β（GSK3β）信號通路探討芥子酸（SA）抗β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）致PC12細(xì)胞損傷的作用機制。方法：將大鼠PC12細(xì)胞隨機分為對照組、Aβ組（Aβ1-42 2 μmol/L）、Aβ+SA組（Aβ1-42 2 μmol/L +SA 100 μmol/L）、Aβ+SA+LY組[Aβ1-42 2 μmol/L +SA 100 μmol/L+LY294002（PI3K抑制劑）10 μmol/L]、Aβ+LY組（Aβ1-42 2 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、LY組（LY294002 10 μmol/L）。除對照組、LY組外，其余各組細(xì)胞均以Aβ1-42復(fù)制損傷模型。培養(yǎng)24 h后，使用顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)，采用MTT法檢測各組細(xì)胞的存活率;采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：與對照組比較，Aβ組細(xì)胞數(shù)量變少、部分突觸斷裂消失，其存活率以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與Aβ 組比較，Aβ+SA組細(xì)胞變圓、突觸變多，其存活率以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著升高（P<0.05）。與Aβ+SA組比較，Aβ+SA+LY組細(xì)胞部分突觸斷裂，其存活率以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低（P<0.05）;Aβ+LY組細(xì)胞碎片較多，其存活率雖有下降但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值亦無明顯變化（P>0.05）。單獨給予 LY294002對PC12細(xì)胞的形態(tài)、存活率以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均無顯著影響（P>0.05）。結(jié)論：SA可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路對Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 芥子酸;β淀粉樣蛋白;磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成激酶3β信號通路;PC12細(xì)胞

中圖分類號 R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）20-2519-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.16

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the mechanism of sinapic acid （SA） against PC12 cell injury induced by Amyloid β1-42 protein （Aβ1-42） based on PI3K/Akt/GSK3β signaling pathway. METHODS： PC12 cells of rats were randomly divided into control group， Aβ group （Aβ1-42 2 μmol/L）， Aβ+SA group （Aβ1-42 2 μmol/L+SA100 μmol/L）， Aβ+SA+LY group [Aβ1-42 2 μmol/L+SA 100? μmol/L+LY294002 （PI3K inhibitor） 10 μmol/L]， Aβ+LY group （Aβ1-42 2 μmol/L+LY294002 10 μmol/L） and LY group （LY294002 10 μmol/L）. Except for control group and LY group， the cells of other groups were replicated the damage model with Aβ1-42. After 24 hours of culture， the morphology of cells was obsened in each group with a microscope， and MTT assay was adopted to determine the cell viability of PC12 cells in each group. Western blotting assay was used to detect the expression of PI3K， p-PI3K， Akt， p-Akt， GSK3β and p-GSK3β in cells of each group. RESULTS： Compared with control group， the number of cells decreased and some synaptic breaks disappeared in Aβ group while cell viability， ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β in? ?Aβ group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with Aβ group， the cells became round and synapses became more in Aβ+SA group while cell viability， the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β were increased significantly （P<0.05）. Compared with Aβ+SA group， some synaptic breaks occurred in Aβ+SA+LY group while cell viability， the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β were decreased significantly （P<0.05）; Aβ+LY group had more cell debris， and the cell viability was decreased， but the difference was not significant， and the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt and p-GSK3β/GSK3β had no significant change （P>0.05）; LY294002 alone had no significant effect on morphology， cell viability and the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt/Akt or p-GSK3β/GSK3β （P>0.05）.? CONCLUSIONS： SA may play a protective role against PC12 cell injury induced by Aβ1-42 through activating PI3K/Akt/GSK-3β.

KEYWORDS? ?Sinapic acid; β-amyloid protein; PI3K/Akt/GSK3β signaling pathway; PC12 cell

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病[1]。AD患者的主要病理特征為β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉積形成的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化引起的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（Neurofibrillarytangles，NFTs）和神經(jīng)細(xì)胞缺失[2]。已有研究顯示，向大鼠腦內(nèi)注射Aβ后，可引起其記憶障礙及神經(jīng)損傷;此外，AD患者大腦中也存在Aβ異常沉積和大量的神經(jīng)細(xì)胞損傷，提示Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷可能為AD發(fā)生的重要原因[3-4]。研究表明，Aβ的主要成分Aβ1-42具有神經(jīng)毒性作用，可致神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性病變[4-5]。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞分化、存活、凋亡的通路之一，也是調(diào)節(jié)受損神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活的重要信號通路[6]。LY294002是一種能夠阻斷上述信號傳導(dǎo)的蛋白激酶抑制劑，可對細(xì)胞中的PI3K信號通路發(fā)揮特異性抑制作用，并可抑制PI3K/Akt信號途徑，如抑制Akt磷酸化等，從而對下游靶蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)[7]。糖原合成激酶3β（GSK3β）是Akt的重要底物，其活性受Akt的負(fù)調(diào)節(jié)，并與Tau蛋白的過度磷酸化密切相關(guān)，同時Aβ的生成和沉積亦能導(dǎo)致Tau蛋白的過度磷酸化[8-9]。已有研究顯示，Aβ的神經(jīng)毒性與PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關(guān)[10-11]，因此找到可調(diào)節(jié)PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關(guān)位點的靶向藥物以對抗Aβ的神經(jīng)毒性，可能成為防治AD的有效方法之一。研究發(fā)現(xiàn)，芥子酸（Sinapic acid，SA）可減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的小鼠海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，使紅藻氨酸引起的小鼠海馬體神經(jīng)細(xì)胞損傷得到改善，并能夠顯著減輕鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠記憶缺陷并抑制神經(jīng)細(xì)胞變性，且呈一定的劑量依賴性[12-13]?；诖?，本研究以Aβ1-42誘導(dǎo)大鼠PC12細(xì)胞制備AD細(xì)胞病理模型，并以LY294002為參照，探討SA的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用及該作用與PI3K/Akt/GSK3β信號通路的潛在關(guān)系，以期為臨床治療AD提供新的思路。

1 材料

1.1 儀器

Series 8000型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;DL-CJ-2NDII型AIRTECH-超凈工作臺（北京東聯(lián)科技有限公司）;M200 PRO型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）;CKX41-A32PH型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;5804R型離心機（德國Eppendorf公司）;165-8001型電泳儀、1703811型電轉(zhuǎn)儀、Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;S11-6-S型恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）;LDZH-200KBS型高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 藥品與試劑

SA對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：S30697，純度：≥97%）;Aβ1-42蛋白（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0107p）;胎牛血清（美國BI公司，批號：04-007-1A）;RPMI培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號：SH30809.01）;LY294002對照品（美國AbMole公司，批號：15447-36-6，純度：100%）;胰蛋白酶（批號：TB150）、青鏈霉素混合液（100×，批號：P1400）、MTT試劑（批號：M8180）、脫脂奶粉（批號：D8340）均購自北京索萊寶科技有限公司;RIPA細(xì)胞裂解液（批號：P0013B）、PMSF蛋白酶抑制劑（100×，批號：P1005）、BCA蛋白濃度試劑盒（100×，批號：P0010S）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×，批號：P00151）、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號：P0018AS）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;磷酸酶抑制劑（100×，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號：CW2383S）;Tween-20、SDS、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、甘氨酸、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司;預(yù)染蛋白標(biāo)志物（加拿大Fermentas公司，批號：26616）;小鼠PI3K單克隆抗體（批號：60225-1-Ig）、小鼠Akt單克隆抗體（批號：60203-2-Ig）、兔GSK3β多克隆抗體（批號：15113-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔p-PI3K單克隆抗體（批號：4228）、兔p-Akt單克隆抗體（批號：4060）、兔p-GSK3β 單克隆抗體（批號：9323）購自美國CST公司;小鼠β-actin 單克隆抗體（批號：TA-09）、辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號：122826）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號：122011）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將PC12細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中，并置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），每 2～3 d 換液1次。

2.2 分組

根據(jù)課題組前期MTT試驗結(jié)果，確定Aβ1-42的最適濃度為2 μmol/L，SA的濃度為100 μmol/L;根據(jù)文獻(xiàn)報道，處理神經(jīng)細(xì)胞時，LY294002的最適濃度為10 μmol/L[14]。將細(xì)胞隨機分為對照組、Aβ 組（Aβ1-42 2 μmol/L）、Aβ+SA組（Aβ1-42 2 μmol/L+SA 100 μmol/L）、Aβ+SA+LY組（Aβ1-42 2 μmol/L+SA 100 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、Aβ+LY組（Aβ1-42 2 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、LY組（LY294002 10? μmol/L）。

2.3 PC12細(xì)胞的形態(tài)觀察和存活率檢測

采用倒置顯微鏡觀察并采用MTT法檢測。收集對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞按5×104個/mL接種至96孔板中，每孔100 mL，按照“2.2”項下方法分組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，Aβ+SA+LY組、Aβ+LY組、LY組先加入LY294002 10 μmol/L孵育1 h;除對照組和LY組外，其余4組分別加入Aβ1-42 2 μmol/L處理24 h以復(fù)制損傷細(xì)胞模型;隨后，Aβ+SA組和Aβ+SA+LY組加入SA 100 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，置于倒置顯微鏡觀察其形態(tài)并拍照。每孔加入 MTT溶液（5 mg/mL）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 150 μL，低速振蕩10 min，以酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測吸光度（OD）值，并按如下公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=樣品組OD均值/對照組OD均值×100%。上述試驗重復(fù)3次。

2.4 PC12中細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達(dá)水平的檢測

采用Western blotting法檢測。收集對數(shù)生長期的P12細(xì)胞，按“2.3”項下方法分組、造模、給藥。培養(yǎng)24 h后，以2 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，加入含胰蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰上裂解后，以12 000 r/min離心20 min，收集上清液即得細(xì)胞總蛋白;采用BCA法測定總蛋白含量，于水浴中煮沸5 min制備所需的變性蛋白樣品;采用10%SDS-PAGE進(jìn)行恒流電泳（電流：60 mA），在恒壓電（電壓：75 V，時間：2 h）以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，于37 ℃下以5%脫脂奶粉封閉 1 h，加入PI3K、Akt、GSK3β一抗（稀釋比例均為1 ∶ 800）和p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β一抗（稀釋比例均為1 ∶ 600），于4 ℃孵育過夜;采用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗3次，每次 5 min，加入二抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗對應(yīng)GSK3β、p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗對應(yīng)PI3K、Akt、β-actin抗體），于 37 ℃下反應(yīng) 1 h，用TBST溶液清洗3次，每次5 min;以ECL顯色后，使用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，采用Image Lab 4.0.1圖像分析軟件檢測蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值來表示其相對表達(dá)量，并以p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β的比值表示PI3K、Akt、GSK3β蛋白的磷酸化水平。上述試驗重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞的形態(tài)

對照組細(xì)胞形態(tài)飽滿、細(xì)胞密集且連接緊密、折光性好。與對照組比較，Aβ組細(xì)胞突觸變少、部分突觸斷裂消失、細(xì)胞變少且細(xì)胞間連接較松;與Aβ組比較，Aβ+SA組細(xì)胞變圓、突觸增多;與Aβ+SA組比較，Aβ+SA+LY組細(xì)胞形態(tài)較不規(guī)則、部分突觸損傷斷裂、細(xì)胞光圈變?nèi)?，Aβ+LY組細(xì)胞碎片較多;LY組細(xì)胞與對照組比較無明顯差異，詳見圖1。

3.2 各組細(xì)胞的存活情況

與對照組比較，Aβ 組細(xì)胞的存活率顯著降低（P<0.01）;與Aβ 組比較，Aβ+SA 組細(xì)胞的存活率顯著升高（P<0.05）;與Aβ+SA 組比較，Aβ+SA+LY組細(xì)胞的存活率顯著降低（P<0.05），而Aβ+LY 組細(xì)胞的存活率雖有下降，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;同時，單獨給予 LY294002對PC12細(xì)胞的存活率無顯著影響（P>0.05），詳見表1。

3.3 各組PC12細(xì)胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK3β、p-GSK3β蛋白水平

與對照組比較，Aβ 組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與Aβ組比較，Aβ+SA 組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著升高（P<0.05）;與Aβ+SA組比較，Aβ+SA+LY 組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK3β/GSK3β比值均顯著降低（P<0.05），而Aβ+LY組細(xì)胞上述指標(biāo)并無顯著變化（P>0.05）;同時，單獨使用LY294002對PC12細(xì)胞的存活率無顯著影響（P>0.05），詳見圖2、表2。

4 討論

AD的病因復(fù)雜，發(fā)病機制尚不清楚，目前的研究認(rèn)為主要與以下幾個因素有關(guān)：Aβ聚集、Tau蛋白過度磷酸化、膽堿能神經(jīng)細(xì)胞損傷、基因突變、炎癥因子增加、衰老、氧化應(yīng)激以及鈣代謝紊亂等[15]。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者的腦內(nèi)有老年斑沉積，而Aβ是構(gòu)成老年斑的主要成分，因此目前認(rèn)為Aβ的異常沉積是AD主要的發(fā)病機制之一[16]。SA是一種天然的羥基肉桂酸，其相對分子量小，具有較高的親脂性，容易透過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，SA能抑制氰化鉀（KCN）導(dǎo)致的小鼠缺氧和記憶障礙，對改善記憶功能有一定的效果[18];同時，SA及其衍生物芥子堿（Sinapine）也對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的AD、共濟失調(diào)和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病有一定的治療作用[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，SA與阿魏酸、香豆酸、咖啡酸等相互作用，具有抗焦慮和改善記憶力的功效[20]。本研究結(jié)果驗證了Aβ1-42能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，而SA能夠拮抗Aβ1-42誘導(dǎo)的這種損傷，說明SA具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，PI3K特異性抑制劑LY294002可逆轉(zhuǎn)SA拮抗Aβ1-42致PC12細(xì)胞損傷及神經(jīng)保護(hù)作用，提示SA對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與PI3K信號通路有關(guān)。

PI3K是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要激酶之一，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110 兩個結(jié)合位點構(gòu)成。當(dāng)受到細(xì)胞外刺激信號分子作用時，p85發(fā)生磷酸化，并解除了對p110的抑制，從而激活PI3K[21]。Akt是PI3K的下游直接靶點，在PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有承上啟下的重要作用，Akt可在Ser473位點發(fā)生磷酸化，使Akt被激活，而許多保護(hù)機制的激活取決于Akt的磷酸化，如神經(jīng)保護(hù)作用[22-23]?；罨腁kt能夠啟動PI3K/Akt信號通路下游級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步磷酸化下游的GSK3β[24]。在最新研究中發(fā)現(xiàn)，GSK3β的神經(jīng)毒性可直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)AD的發(fā)生;然而GSK3β磷酸化水平的增高則可抑制GSK3β的活性，減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷[25]。另有研究表明，SA可通過PI3K/Akt/GSK3β下游的p38絲裂原活化蛋白激酶/環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（MAPK/CREB）信號通路，啟動3T3-L1脂肪細(xì)胞褐變，提示SA可參與PI3K/Akt/GSK3β信號通路的調(diào)控[26]。本研究結(jié)果顯示，Aβ1-42可顯著降低PC12細(xì)胞中PI3K、Akt、GSK3β的磷酸化水平，SA能夠回調(diào)Aβ1-42誘導(dǎo)的上述蛋白的磷酸化;而LY294002可逆轉(zhuǎn)SA對PI3K、Akt、GSK3β磷酸化水平的回調(diào)作用。這說明SA對Aβ1-42致細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能是通過活化PI3K，使其下游靶點蛋白Akt磷酸化，從而使下游底物GSK3β發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活PI3K/Akt/GSK3β信號通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SA對Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機制可能與其激活PI3K/Akt/GSK3β信號通路有關(guān)。由于AD的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，本研究只檢測了PI3K、Akt、GSK3β，未檢測PI3K/Akt信號通路的其他蛋白，如B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動子（Bad）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）等[26]，因此還有待于進(jìn)一步研究加以證實。

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（收稿日期：2020-04-04 修回日期：2020-08-04）

（編輯：羅 瑞）