吳博澤 郭俊佩 劉璇 高建華 李大衛(wèi) 史宗勇

摘? ? 要：獼猴桃是原產(chǎn)中國的多年生藤本果樹，廣泛分布于中國低緯度到高緯度地區(qū)。隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展和種植區(qū)域的不斷北擴(kuò)南移，異常氣候變化嚴(yán)重限制了獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其中低溫脅迫已經(jīng)成為影響獼猴桃果樹生長、果實品質(zhì)和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。本文圍繞低溫脅迫對獼猴桃的生長、生理生化影響及獼猴桃低溫脅迫應(yīng)答分子機(jī)制3方面進(jìn)行綜述，為獼猴桃抗低溫脅迫研究以及抗逆品種選育提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：獼猴桃;低溫脅迫;生長形勢;生理生化;分子機(jī)制

中圖分類號：S663.4? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.08.017

Abstract： As a perennial woody fruit tree， kiwifruit is native to China and widely distributed from low latitude to high latitude. With the rapid development of kiwifruit industry， kiwifruit planting areas are expanding in the South and North of China. At present， abnormal climate change has seriously restricted the development of kiwifruit industry， and low temperature stress has become one of the key factors affecting kiwifruit's growth， fruit quality and yield. In this paper， we reviewed the effects of low temperature stress on the kiwifruit's growth， physiology and biochemistry， and discussed the molecular mechanism of kiwifruit responding to low temperature stress. This paper will provide theoretical basis for the study of kiwifruit resistance to low temperature stress and variety breeding with low temperature resistant.

Key words：? kiwifruit; low-temperature stress; growth performance; physiological and biochemical mechanism; molecular mechanism

獼猴桃（Actinidia）原產(chǎn)于中國，是隸屬于獼猴桃科獼猴桃屬的落葉藤本類果樹[1]。獼猴桃屬植物呈現(xiàn)多樣化的物種分布格局，其自然分布于赤道與北緯50°之間亞洲東部地區(qū)，物種分布中心位于中國西南山區(qū)[2]。中國獼猴桃人工栽培種植始于20世紀(jì)70年代末，隨后種植面積迅速擴(kuò)大，2016年我國獼猴桃種植面積達(dá)19萬hm2，產(chǎn)量占全球獼猴桃行業(yè)總產(chǎn)量的一半以上[3]。

溫度是限制獼猴桃分布和生長發(fā)育的主要因素，低溫脅迫抑制植物生長常造成世界農(nóng)林生產(chǎn)的巨大損失[4]。近幾年，氣候變化異常，獼猴桃果園經(jīng)常遭受低溫天氣帶來的影響，一些國內(nèi)外獼猴桃產(chǎn)區(qū)如中國陜西、意大利、新西蘭均有獼猴桃的凍害報道。針對極端低溫天氣對獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成的損失這一個重要課題，本研究從獼猴桃在低溫脅迫下的生長發(fā)育、生理生化以及分子機(jī)理3個方面進(jìn)行綜述研究，以期為獼猴桃耐低溫脅迫種質(zhì)資源篩選和新品種的選育等提供理論支持。

1 低溫脅迫對獼猴桃生長形勢的影響

低溫脅迫包括冷脅迫和凍脅迫，是一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害，對獼猴桃的產(chǎn)量影響很大，低溫凍害發(fā)生在春季萌芽期會造成幼芽和花苞被凍死減產(chǎn)，發(fā)生在冬季越冬期則會造成絕收[5]。

1.1 低溫脅迫對獼猴桃長勢影響的常用研究方法

低溫對獼猴桃生長發(fā)育影響的最主要研究方法是凍害調(diào)查研究，齊秀娟等[6]在調(diào)查研究的基礎(chǔ)之上，發(fā)現(xiàn)枝條的厚角組織厚度與枝條電解質(zhì)滲出率呈指數(shù)函數(shù)顯著相關(guān);枝條的厚角組織厚度/直徑比率與枝條電解質(zhì)滲出率呈現(xiàn)多項式非線性顯著相關(guān);木質(zhì)部/直徑比率與電解質(zhì)滲出率呈對數(shù)函數(shù)顯著相關(guān)，嘗試?yán)弥l組織特征指標(biāo)對獼猴桃樹體抗寒性狀開展形態(tài)學(xué)鑒定。Hewett等[7-8]則通過測定冷處理后枝條的發(fā)芽率、植株存活率的試驗方法，探討不同季節(jié)氣溫對獼猴桃的低溫?fù)p傷表現(xiàn)。

1.2 低溫脅迫對不同樹齡的影響

在倒春寒、雪、霜等氣候條件下，氣溫驟減導(dǎo)致獼猴桃的生長發(fā)育等生命活動受到嚴(yán)重影響，遭遇低溫的果樹大多有花無果，花小易落。低溫傷害程度與樹齡、樹勢有關(guān)，劉占德等[9]調(diào)查發(fā)現(xiàn)凍害對初掛果果園和長勢過旺的幼樹傷害嚴(yán)重。安成立等[10]調(diào)查結(jié)果表明，受凍程度隨著樹齡的增大則凍害愈輕，其中實生苗、嫁接樹凍害表現(xiàn)一致。在受凍樹齡中1年樹齡樹受凍最嚴(yán)重，2年樹齡樹死亡率較高，而同期調(diào)查4年以上樹齡樹幾乎無凍害發(fā)生，主莖也幾乎未受影響，所以獼猴桃果樹隨著樹齡增大凍害可能減輕。

1.3 低溫脅迫對不同器官的影響

低溫凍害對獼猴桃的影響主要是地上部分，花芽和嫩葉凍害主要發(fā)生在春季，凍害發(fā)生后花芽和嫩葉出現(xiàn)萎縮、下垂、顏色褐變，繼而干枯脫落[11]。枝條凍害發(fā)生在冬末至次年初春，主要傷及1年生營養(yǎng)枝條，新梢受凍軟化皺縮或髓部變色，嚴(yán)重時枝干有縱向開裂有褐色傷流;主蔓凍害主要發(fā)生在植株體內(nèi)水分含量高的春季生長期，受凍部位主要在地面以上至50 cm以下這個區(qū)段，離地面15～30 cm處皮層松軟、褐變、有縱裂紋，手輕搓極易脫落，木質(zhì)部呈褐色[9]。地下部分根部凍害主要發(fā)生在冬季至次年初春，極端長期冰凍導(dǎo)致根部土層嚴(yán)重墑情，受凍植株根系先期鮮嫩，隨地溫回升逐步變褐，皮層腐、脫落，伴有植株地上部分凍害表現(xiàn)，最終導(dǎo)致全株死亡[12]。

1.4 低溫脅迫對不同品種的影響

國內(nèi)外調(diào)查和試驗研究結(jié)果表明不同品種獼猴桃耐低溫凍害表現(xiàn)差異明顯。黃永紅等[13]針對2016年泰山南麓獼猴桃凍害調(diào)查表明，抗寒力最強(qiáng)的是‘魁綠、‘秦美、‘泰山1號、‘華特，抗寒力較強(qiáng)的是‘金艷、‘紅陽、‘華優(yōu)，抗寒力較弱的為‘徐香。齊秀娟等[6]調(diào)查發(fā)現(xiàn)中華獼猴桃抗凍能力強(qiáng)于美味獼猴桃，并且從實生苗的觀察中發(fā)現(xiàn)雄株抗凍害能力強(qiáng)于雌株。Testolin等[14]對意大利北部凍害調(diào)查同樣發(fā)現(xiàn)美味獼猴桃‘海沃德雄株耐凍性略高于雌株。劉占德等[9]從2007—2011年連續(xù)5年調(diào)查表明，凍害表現(xiàn)出品種間規(guī)律性差異，調(diào)查品種中抗性由強(qiáng)到弱依次為‘海沃德、‘秦美，其次是‘徐香，而‘紅陽則凍害頻發(fā)，受凍程度最為嚴(yán)重。

2 低溫脅迫對獼猴桃生理生化的影響

2.1 低溫脅迫對細(xì)胞水分的影響

植物細(xì)胞含水量高達(dá)70%，當(dāng)氣溫降到冰點以下時，溫度的驟然降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)過冷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，形成的胞內(nèi)冰晶體破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成致命傷害。同時，植物在質(zhì)外體空間出現(xiàn)細(xì)胞間隙結(jié)冰，會引起細(xì)胞內(nèi)外滲透壓改變導(dǎo)致原生質(zhì)過度脫水，破壞蛋白質(zhì)分子，原生質(zhì)凝固變性細(xì)胞壞死[15-16]。

特別是當(dāng)獼猴桃經(jīng)歷寒冬深冬眠后轉(zhuǎn)入生長發(fā)育階段，此期氣溫回升、濕度增加，營養(yǎng)器官開始活動，處于生長期的組織細(xì)胞水分充足，天氣突變氣溫稍低于冰點溫度植株株體器官外、細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)均會結(jié)冰形成凍害。這也很好地解釋了低溫對不同樹齡、不同器官的傷害。

2.2 低溫脅迫對細(xì)胞膜的影響

細(xì)胞膜是生物感受外界脅迫的第一道屏障，凍害嚴(yán)重時胞內(nèi)冰晶體會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。在低溫脅迫下，隨著溫度降低，細(xì)胞膜流動性下降、透性增強(qiáng)，而透性增強(qiáng)使細(xì)胞水溶性物質(zhì)外泄，導(dǎo)致細(xì)胞受損。對高山離子芥的試驗表明，細(xì)胞膜的流動性與膜上不飽和脂肪酸含量正相關(guān)，質(zhì)膜上不飽和脂肪酸在植株耐寒上有很重要的作用，低溫造成細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的不飽和度和脂質(zhì)過氧化作用的改變[17-18]。

植物細(xì)胞在低溫脅迫下胞內(nèi)水溶性物質(zhì)外滲，能引起細(xì)胞導(dǎo)電性的變化，電導(dǎo)率的大小與植物受冷害的程度呈正相關(guān)，能夠直觀反映受低溫脅迫后細(xì)胞的膜損傷程度，人們用電導(dǎo)法測定離體植物的抗凍性，經(jīng)不斷完善，開始通過梯度低溫條件下植物電導(dǎo)率結(jié)合logistic方程確定植物組織低溫半致死溫度，以描述低溫對細(xì)胞膜傷害的過程[20-21]。利用電導(dǎo)率測定，王在明等[21]發(fā)現(xiàn)中華獼猴桃耐寒性則比毛花獼猴桃強(qiáng)。丁文龍[22]通過對5個種的10個獼猴桃品系不同溫度處理下電導(dǎo)率測定，推導(dǎo)半致死溫度評價品系抗寒性，結(jié)果表明軟棗、葛棗獼猴桃中半致死溫度低于其他種，與田間觀察一致。但電導(dǎo)率測試還有很大的改進(jìn)和優(yōu)化空間，Lawesa等[23]測定冷處理后發(fā)芽率，結(jié)果表明京梨獼猴桃抗寒性最低，而軟棗、狗棗、葛棗3種東北地區(qū)獼猴桃抗寒性最強(qiáng)，同時比較組織褐變以及電導(dǎo)率等測定手段，發(fā)現(xiàn)組織褐變與電導(dǎo)率測定方法還需進(jìn)一步優(yōu)化。孫世航等[24]研究了獼猴桃枝條枝條低溫處理時間以及去離子水浸泡時間對電導(dǎo)率值的影響，發(fā)現(xiàn)8 h處理以及2 h去離子水浸泡的獼猴桃枝條電導(dǎo)率能達(dá)到最優(yōu)擬合曲線，能夠較好地預(yù)測獼猴桃枝條的半致死溫度。

2.3 低溫脅迫對細(xì)胞酶活性的影響

光合作用是決定植物發(fā)育的主要因素，也是冷害時第一個被抑制的代謝過程[25]。光合作用的碳同化過程涉及多個復(fù)雜的酶促反應(yīng)，低溫脅迫主要通過抑制各種生物酶的活性抑制光合作用的碳同化過程[26]。對霜后軟棗獼猴桃測定葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線，表明其電子傳遞鏈?zhǔn)荏w側(cè)受到顯著傷害且PSⅠ受到影響，而供體側(cè)則基本無影響[27]。

植物擁有一套有效的抗氧化酶系統(tǒng)（如CAT、SOD、POD等）調(diào)節(jié)自身氧化還原系統(tǒng)動態(tài)平衡[28]，過量的活性氧（ROS）聚集對細(xì)胞有害，冷馴化可使植物體內(nèi)抗氧化物酶系統(tǒng)加強(qiáng)，控制ROS的過量產(chǎn)生和及時清除過量的ROS，提高植物對活性氧的耐受力[29]。低溫對彌猴桃抗氧化酶系統(tǒng)的影響是一個復(fù)雜的過程，對軟棗獼猴桃晚秋到春天的抗氧化酶變化研究表明SOD、POD活性均隨氣溫降低而上升，而CAT則相反[30]。對中華獼猴桃、狗棗獼猴桃及雜交系低溫脅迫研究表明：SOD在4 ℃以上隨溫度降低而降低，但在4 ℃以下隨溫度降低而升高，POD則無一般趨勢[31]。對軟棗獼猴桃梯度低溫處理表明，SOD、POD、CAT三個抗氧化酶活性均呈現(xiàn)隨溫度降低先升后降的趨勢，且在-35 ℃取得最大值[32]。不同獼猴桃品種在低溫處理下的抗氧化酶活性變化趨勢又呈現(xiàn)其復(fù)雜性[33-34]。

2.4 低溫脅迫對細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與植物耐寒性有密切的關(guān)系，在低溫脅迫下，植物通過積累各種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高自身的滲透調(diào)節(jié)能力[35]。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)細(xì)胞液可溶性糖在為細(xì)胞提供能量的同時，導(dǎo)致細(xì)胞溶液濃度升高冰點溫度降低，進(jìn)而降低低溫對細(xì)胞損傷;可溶性蛋白能有效提高細(xì)胞膠體滲透壓，低溫脅迫下增加細(xì)胞內(nèi)束縛水的含量降低細(xì)胞受損程度;脯氨酸能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體保護(hù)低溫脅迫下蛋白質(zhì)的完整性，降低細(xì)胞質(zhì)凝固點，防止細(xì)胞脫水[36]。對軟棗獼猴桃低溫脅迫研究表明，隨著低溫脅迫時間延長或處理溫度下降會引起細(xì)胞內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透保護(hù)物在一定范圍內(nèi)增多[30， 32， 34]。

低溫脅迫對細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響呈多樣性變化，調(diào)節(jié)機(jī)理有待繼續(xù)研究。孫世航[33]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫研究中華獼猴桃，脯氨酸含量隨處理溫度降低呈先升后降趨勢，但可溶性糖、可溶性蛋白含量則呈現(xiàn)更多樣的變化;美味獼猴桃的脯氨酸、可溶性蛋白含量大體隨處理溫度降低呈下降趨勢，而可溶性糖含量變化相對平穩(wěn)。也有研究認(rèn)為由于可溶性蛋白合成影響因素較多，低溫脅迫下可溶性蛋白質(zhì)濃度存在不增反降現(xiàn)象[37]。

3 獼猴桃低溫脅迫應(yīng)答分子機(jī)制

早在1970年，Weiser就提出低溫脅迫下植物會通過冷信號誘導(dǎo)相關(guān)抗寒基因的表達(dá)。當(dāng)植物遭受低溫脅迫時，低溫通過刺激植物細(xì)胞膜上的蛋白受體，使低溫信號沿著“膜蛋白受體-Ca2+ -蛋白激酶-轉(zhuǎn)錄因子-抗寒基因”途徑在植物細(xì)胞內(nèi)逐級傳遞[38]。近年來對抗低溫脅迫調(diào)控的研究聚焦于ICE-CBF-COR依賴的冷信號通路，該通路基因數(shù)量約占冷調(diào)控基因的10%～25%，是植物低溫脅迫響應(yīng)的重要組成部分[39]。環(huán)境剌激通過細(xì)胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活調(diào)控因子ICE（inducer of CBF expression），激活后的ICE蛋白結(jié)合到CBF（C-repeat-binding factors）基因啟動子區(qū)的ICE box上，誘導(dǎo)CBF基因的表達(dá)[40-41]。CBF與抗寒基因COR（cold regulated）含有的CRT順式作用元件結(jié)合而啟動COR的表達(dá)，產(chǎn)生抗冷分子或催化抗冷分子合成的酶，最終使植物獲得抗冷性[42]。

圍繞獼猴桃低溫脅迫的上游調(diào)控因子ICE，張慶田等[43]通過蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測以及構(gòu)建不同物種ICE1基因進(jìn)化樹等生物信息學(xué)手段找出軟棗獼猴桃ICE1序列，之后利用冷處理后的軟棗獼猴桃mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成功克隆出推定的軟棗獼猴桃ICE1基因，為軟棗低溫脅迫的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。依賴CBF的冷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是賦予植物低溫抗性的主效途徑，Gunaseelan等[44]對獼猴桃果實進(jìn)行冷處理、外施乙烯、成熟度的轉(zhuǎn)錄組測序鑒定了5個與冷處理相關(guān)的具有不同拷貝數(shù)的CBF候選基因。時朝等[45]利用4 ℃處理的軟棗獼猴桃扦插苗木材料，進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳分析發(fā)現(xiàn)了63個差異表達(dá)蛋白，結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，鑒定11個蛋白與光合作用、糖代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆以及基因調(diào)控過程等相關(guān)。針對獼猴桃低溫脅迫抗寒基因，經(jīng)過抗低溫脅迫分子的篩選和高通量測序方法，F(xiàn)ang等[46]對軟棗獼猴桃種質(zhì)的Ruby-3、Yongfeng male、Kuilv male、和Hongbei male四種基因型進(jìn)行重測序獲得的非同義SNPs和InDels位點基因注釋，為提高耐寒性獼猴桃育種打下了基礎(chǔ)。

獼猴桃低溫脅迫的研究往往與其他非生物脅迫結(jié)合開展，獼猴桃AcMYB3R基因包含3個MYB結(jié)構(gòu)域，在非生物脅迫中起重要作用，Zhang等[47]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)獼猴桃AcMYB3R基因的擬南芥植株耐受高鹽與干旱脅迫，該基因同樣響應(yīng)于低溫脅迫。將獼猴桃AdADH1和AdADH2基因?qū)霐M南芥株的試驗，表明AdADH1起著耐澇、耐鹽堿、耐寒的作用，AdADH2起著抗鹽堿、抗?jié)车淖饔肹48]?？箟难釙谥参锩媾R壞境壓力時起抗氧化作用，Li等[49]通過抗壞血酸的關(guān)鍵酶基因GME基因在葉片中表達(dá)，表明其在低溫脅迫中上調(diào)。繞轉(zhuǎn)錄因子基因家族AP2/ERF中的RAV 類基因，張計育等[50]發(fā)現(xiàn)4 ℃低溫處理48 h后‘金魁獼猴桃AdRAV3表達(dá)水平顯著升高，表明AdRAV3響應(yīng)冷脅迫并參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

4 問題與展望

低溫脅迫是獼猴桃栽培中常常遇到的一種自然災(zāi)害，它不僅會影響獼猴桃的品質(zhì)和產(chǎn)量，嚴(yán)重時還會造成植株的死亡，培育抗寒品種是減少凍害的重要手段。獼猴桃種質(zhì)資源多種多樣，前期研究表明軟棗獼猴桃、葛棗獼猴桃等物種能夠在零下30 ℃以下低溫成果越冬。通過對加深這些物種的系統(tǒng)抗凍性，與現(xiàn)有商業(yè)化栽培的中華獼猴桃和美味獼猴桃等開展種間雜交，選育新型的抗凍種質(zhì)，這無疑將為未來獼猴桃的抗凍新品種選育提供有用的材料。然而，大量收集及評價獼猴桃資源及開展雜交育種同樣存在工作量大、育種周期長缺點。如何將野生和實生選優(yōu)與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，加速育種進(jìn)程和定向育種是急需解決的一個問題。

我國野生獼猴桃資源豐富，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，可將抗寒生理學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)合，加強(qiáng)基因組學(xué)技術(shù)在獼猴桃育種中的應(yīng)用，進(jìn)一步精確挖掘與低溫脅迫相關(guān)的基因，完善獼猴桃抗低溫脅迫的信號通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以更好地揭示其抗性的內(nèi)在作用機(jī)制，同時運(yùn)用分子標(biāo)記、基因編輯等技術(shù)，提高獼猴桃在逆境抗性方面的能力，為優(yōu)質(zhì)、高抗、高產(chǎn)的獼猴桃良種選育奠定基礎(chǔ)。

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