吳再輝

摘 要：目的：基于光干涉原理的生物親和性檢測技術(shù)，實現(xiàn)甾體類激素動力學(xué)參數(shù)及定性與定量檢測。方法：利用阻遏蛋白RepA與3α-HSD/CR的回文序列基因及甾體類激素的特異性結(jié)合，建立一種非標(biāo)記光學(xué)原理的甾體類激素檢測新方法。結(jié)果：檢測了睪丸酮叢毛單胞菌雙鏈DNA OP1與RepA特異親和性，親和常數(shù)KD為9.865×10-9M，建立了環(huán)境監(jiān)測中雙鏈DNA OP1與RepA抑制法的甾體類激素總量定量檢測新方法，最低檢測限0.45ng/ml;結(jié)論：本文在研究光干涉生物親和性關(guān)鍵檢測技術(shù)基礎(chǔ)上，建立快速、靈敏、特異的環(huán)境監(jiān)測中甾體類激素總量的新型應(yīng)用檢測方法，實現(xiàn)甾體類激素的定量檢測，為環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的生物應(yīng)用提供新方法。

關(guān)鍵詞：光干涉原理;甾體類激素;3α-羥類固醇脫氫酶/碳?；€原酶（3α-HSD/CR）;阻遏蛋白RepA

生物分子的親和性檢測是指通過實時監(jiān)測其相互作用過程，獲得分子間是否發(fā)生作用，作用強度等信息，揭示微觀生命活動規(guī)律的重要方法。該方法具有檢測時間短、精度高、成本低廉等特點，對病毒、細(xì)菌及毒素的檢測、臨床用藥篩選等方面有著廣泛的應(yīng)用[1-3]，是目前檢測領(lǐng)域研究熱點。

甾體類激素在維持生命和調(diào)節(jié)性功能等方面有著極其重要的作用。人工合成激素類物質(zhì)能夠模仿生理激素對生物體產(chǎn)生誘導(dǎo)反應(yīng)，干擾體內(nèi)代謝信號通路[4]，屬于一類致癌物質(zhì)[5]。目前，對于環(huán)境甾體類激素的檢測主要以液相與質(zhì)譜等大型進(jìn)口儀器為主[6，7]，價格昂貴、操作復(fù)雜、僅適用于實驗室環(huán)境檢測，并且僅能檢測單一組分的已知環(huán)境甾體類激素污染物，因此迫切需要建立一種快速、靈敏、高通量、實時、原位檢測環(huán)境甾體類激素總量的新方法。

睪丸酮叢毛單胞菌（C.testosteroni，C.T.）ATCC 11996是一種以甾體類激素作為碳源及能源[8，9]的微生物，其中3α-羥類固醇脫氫酶/碳?；€原酶（3α-HSD/CR）在甾體類激素代謝途徑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10，11]。其基因上游含有兩個10bp回文操縱序列[12]，其基因附近還有一個RepA，在沒有甾體類激素時，RepA與回文序列基因相結(jié)合，抑制3α-HSD/CR的表達(dá);當(dāng)有甾體類激素存在時，RepA與甾體類激素特異性結(jié)合，構(gòu)象發(fā)生改變，啟動3α-HSD/CR基因的表達(dá)功能[13]。

本文將dsDNA固定到SA光纖探針表面，光干涉生物親和性傳感檢測系統(tǒng)實時監(jiān)測dsDNA與RepA的相互作用曲線，非線性擬合獲得相互作用動力學(xué)參數(shù);同時建立dsDNA、RepA與甾體類激素間的抑制檢測法，以最大響應(yīng)信號與甾體類激素濃度建立定量關(guān)系，實現(xiàn)甾體類激素的定量檢測，為環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的生物應(yīng)用提供新方法。

1 材料與試劑

睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品，N-月桂酰肌氨酸鈉鹽（SKL）（購自Dr.Ehrenstorfer）;5-Biotin修飾單鏈DNA（ssDNA）片段（上海生工合成）;阻遏蛋白RepA原核表達(dá)菌株BL21-pET-15b-RepA（實驗室保存）。

2 實驗方法

2.1 RepA的表達(dá)與純化

BL21-pET-15b-RepA在110rpm，16℃下進(jìn)行原核表達(dá)，在表達(dá)過程中加入終濃度0.5%SKL溶液提取蛋白。采用SDS-PAGE電泳及Bradford方法對純化蛋白進(jìn)行鑒定及含量測定[14]。

2.2 OP1的合成

分別合成ssDNA上/下游10OD 5末端標(biāo)記生物素（Biotin）的含有回文序列的OP1，及陰性對照CO片段。并采用退火方法[15]將合成的單鏈互補形成雙鏈DNA（dsDNA）。OP1：5bioin-GCAGCTCGGCCATGTCAAAGCCCAGCGGCCCCGCGCCC;CO：5biotin-GGCCACGGTAAATTTTCCCTAGGGGAATTACATCGTCC

2.3 dsDNA與RepA親和性檢測

采用光干涉生物親和性傳感檢測系統(tǒng)與SA光纖探針，以dsDNA為生物特異性固定分子研究dsDNA在光纖探針表面的最適固定濃度。檢測過程：平衡階段;最適濃度Biotin-dsDNA固定階段;平衡階段;與不同濃度RepA結(jié)合反應(yīng)階段;解離反應(yīng)階段。以dsDNA CO為陰性對照，以PBS-T緩沖液作為dsDNA與RepA蛋白稀釋液、空白對照、平衡階段及解離階段溶液。所有溶液均吸取200μl置于黑色微孔板內(nèi)，1000rpm混勻，恒溫30℃。

2.4 dsDNA與RepA蛋白抑制法甾體類激素定量檢測新方法

以不同濃度睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品與20μg/ml RepA提前孵育，封閉RepA的激素結(jié)合位點，使其DNA結(jié)合位點構(gòu)象改變。方法見2.3。

2.5 方法學(xué)可行性對比

采集吉林省內(nèi)某養(yǎng)殖魚塘水樣，采用氯仿粗提法提取水樣中的甾體類激素，然后分別采用HPLC方法、非細(xì)胞體系高效生物化學(xué)發(fā)光傳感器方法[16]及本文建立方法對魚塘水樣中睪丸酮含量進(jìn)行檢測，研究方法精密度與準(zhǔn)確度。

3 結(jié)果

3.1 RepA的鑒定

如圖1所示，表達(dá)及純化的RepA蛋白分子量為48kDa，濃度為0.58mg/ml。

3.2 dsDNA在SA光纖探針表面固定的最適濃度

dsDNA OP1在0.125～4μM倍比稀釋濃度范圍內(nèi)，分別固定于SA光纖探針表面，達(dá)到平衡后的光譜響應(yīng)信號值如圖2所示，最適濃度為1μM時，光纖探針表面dsDNA自組裝達(dá)到飽和狀態(tài)，光譜響應(yīng)信號不再變化。

3.3 dsDNA與RepA相互作用動力學(xué)參數(shù)測定

分別采用8只SA光纖探針固定Biotin-dsDNA OP1，如圖3所示，最大響應(yīng)信號的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為5.76%，說明光纖探針一致性較好。

采用固定有dsDNA OP1 SA光纖探針，檢測dsDNA OP1與RepA的親和性。對每個濃度結(jié)合曲線做y=y0+a1-e-kaC+kdt非線性擬合，對解離曲線做y=ae-kd（t-t0）非線性擬合，獲得動力學(xué)參數(shù)結(jié)果如表1所示，結(jié)合速率常數(shù)ka=1.196×1041/Ms、解離速率常數(shù)kd=1.179×10-41/s、親和常數(shù)KD=9.865×10-9M。親和常數(shù)越小，親和性越高，說明RepA與dsDNA OP1親和性高;RepA與陰性對照dsDNA CO無交叉反應(yīng)，說明RepA與dsDNA OP1相互作用具有特異性。

3.4 甾體類激素定量檢測新方法

將不同濃度睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品與RepA提前孵育，封閉RepA激素結(jié)合位點，改變RepA蛋白構(gòu)象，從而無法與dsDNA OP1發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。抑制法檢測甾體類激素反應(yīng)過程曲線如圖4所示，最大信號響應(yīng)值與睪丸酮濃度呈負(fù)相關(guān)。

a：預(yù)混溶液中不含睪丸酮的空白對照曲線;b-k：預(yù)混溶液中含有終濃度為0.534～546.500ng/ml范圍內(nèi)倍比稀釋的睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線;m：預(yù)混溶液中含有終濃度為1093ng/ml的睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)曲線。

每濃度重復(fù)測定3次，定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，檢測時間為24min，睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品在0.534～546.500ng/ml濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程符合Logistic四參數(shù)非線性擬合，R2=0.988?？瞻讓φ諡?00μl RepA與100μl PBS-T預(yù)混勻孵育，最低檢測限（LOD）為空白對照響應(yīng)值3SD對應(yīng)的睪丸酮濃度，經(jīng)實驗為0450ng/ml，定量限（LOQ）為空白對照響應(yīng)值10SD對應(yīng)的睪丸酮濃度，經(jīng)實驗為2.351ng/ml。

3.5 檢測甾體類激素的方法學(xué)對比

通過三種方法對水樣甾體類激素的檢測結(jié)果與加標(biāo)回收實驗結(jié)果對比，說明光干涉抑制法在總量檢測方面優(yōu)于HPLC方法，在檢測方法精密度與準(zhǔn)確度方面優(yōu)于非細(xì)胞體系生物化學(xué)發(fā)光傳感器檢測方法。

4 討論

采用光干涉生物親和性傳感檢測系統(tǒng)及SA光纖探針，檢測睪丸酮叢毛單胞菌（C.testosteroni，C.T.）ATCC 11996中dsDNA OP1與RepA的相互作用動力學(xué)參數(shù)，其中親和常數(shù)KD分別為9.865×10-9M，親和常數(shù)越小，親和性越高。利用本文建立的方法與HPLC方法及非細(xì)胞體系高效生物化學(xué)發(fā)光傳感器檢測方法進(jìn)行對比，結(jié)果表明，本文建立的光干涉生物親和性傳感檢測抑制方法在甾體類激素總量的檢測中優(yōu)于HPLC方法的單一物質(zhì)檢測;檢測方法加標(biāo)回收率為9440%～110.14%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.60%～12.65%，說明檢測方法精密度與準(zhǔn)確度好;樣品前處理簡單，能夠應(yīng)用于環(huán)境中甾體類激素總量的快速檢測。

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