鐘小廷，呂杰，易謙武，劉迎濤，李可

(1.四川新希望味業(yè)有限公司，成都 610000；2.成都國(guó)釀食品股份有限公司，成都 610000；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，成都 610000)

醬油是我國(guó)的傳統(tǒng)調(diào)味品，生產(chǎn)歷史悠久。醬油風(fēng)味的形成依賴于多種微生物及其產(chǎn)生的酶對(duì)蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等物質(zhì)的代謝和分解作用，生成氨基酸、小肽、糖分、甘油、有機(jī)酸及多種物質(zhì)，從而形成醬油特有的風(fēng)味和滋味特征[1,2]。

隨著對(duì)醬油發(fā)酵菌種、工藝和風(fēng)味特性研究的深入，越來越多的研究表明，在醬油發(fā)酵過程中添加耐鹽酵母如魯氏酵母、球擬酵母等能夠有效解決傳統(tǒng)釀制醬油風(fēng)味、香氣不足的問題，顯著提高醬油產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)[3-5]。 酵母在醬油發(fā)酵過程中不僅能夠產(chǎn)生醇類、醛類、羧酸類、酯類、酚類、呋喃類、吡嗪類等物質(zhì)使醬油呈現(xiàn)獨(dú)特的香氣，而且乙醇等物質(zhì)的生成還有一定的抑菌作用，利于醬油風(fēng)味物質(zhì)的釋放及醬油的保存等。也有研究表明，接種的魯氏酵母和球擬酵母對(duì)發(fā)酵過程中氨基酸、糖、有機(jī)酸等滋味物質(zhì)的代謝也有影響，一方面，酵母能夠改變發(fā)酵群落結(jié)構(gòu)，提高糖的利用率，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，提高醬油中關(guān)鍵鮮味物質(zhì)谷氨酸含量[6]；另一方面，酵母自溶產(chǎn)生寡肽、氨基酸、核酸組分及糖類等呈味物質(zhì)/前體物質(zhì)[7]，也會(huì)影響醬油的風(fēng)味品質(zhì)。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)醬油發(fā)酵過程中酵母的研究主要集中在高產(chǎn)酒精酵母和耐鹽酵母菌的選育優(yōu)化、改善醬油風(fēng)味及醬油風(fēng)味成分分析等方面[8-10]，而酵母添加對(duì)醬油滋味物質(zhì)的影響尚未見報(bào)道。本文通過比較實(shí)際生產(chǎn)中，高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝條件下外源添加魯氏酵母、球擬酵母對(duì)醬油品質(zhì)以及關(guān)鍵滋味物質(zhì)游離氨基酸組成等的影響，為闡明酵母添加對(duì)醬油滋味的影響及其物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：米曲霉(Aspergillusoryzae)滬釀3.042、魯氏酵母AS2.180、球擬酵母AS2.202,成都國(guó)釀食品股份有限公司菌種保藏中心保藏。

原料：黑豆、小麥、食鹽，市售。

設(shè)備：酸度計(jì)、磁力攪拌器、722N型分光光度計(jì)、FA2004B型電子天平、202-2型電熱恒溫干燥箱、L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀。

試劑：2.5 μmol/mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液B1、B2、B3、B4、B5和茚三酮顯色液：日本日立公司；其余試劑(均為分析純)：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵工藝流程

發(fā)酵工藝流程見圖1。

圖1 發(fā)酵工藝流程圖(酵母添加組和非添加組各3個(gè)處理)

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)

總酸、氨基酸態(tài)氮、食鹽、全氮、可溶性無鹽固形物參照GB 18186—2000進(jìn)行測(cè)定；

酒精采用分光光度法測(cè)定[11]；

還原糖參照GB 5009.7—2016第一法進(jìn)行測(cè)定；

氨基酸參照范霞等[12]的方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Origin Pro 19.b分析常規(guī)指標(biāo)的平均值及方差分析，顯著性分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，氨基酸含量數(shù)據(jù)經(jīng)z-score標(biāo)準(zhǔn)化方法標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行PCA分析，采用Heml 1.0做熱圖和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源添加酵母對(duì)醬油常規(guī)指標(biāo)的影響

氯化鈉、氨基酸態(tài)氮、總氮、還原糖、總酸、乙醇含量及pH等是反映醬油品質(zhì)優(yōu)劣的重要基礎(chǔ)指標(biāo)，與發(fā)酵微生物有密切聯(lián)系。郭建等[13]的研究結(jié)果顯示不同代表性的魯氏酵母和球擬酵母在不同接種方式下對(duì)醬油的氨基酸態(tài)氮、總酸、乙醇以及還原糖等指標(biāo)均無影響。宋茜研究認(rèn)為，不同菌株對(duì)醬油的總氮、氨基酸態(tài)氮等有顯著影響[14]。李學(xué)偉等認(rèn)為，低鹽稀態(tài)工藝條件下，醬油中添加酵母能夠明顯提高醬油的總酸、乙醇含量，氨基酸態(tài)氮含量降低，而對(duì)還原糖無顯著影響[15]。由此可知，酵母添加對(duì)醬油品質(zhì)的影響也會(huì)隨著原料、酵母菌種、工藝條件的不同而不同。

圖2 酵母添加對(duì)醬油常規(guī)指標(biāo)的影響

本文通過對(duì)比分析了高鹽稀態(tài)發(fā)酵條件下，魯氏酵母和球擬酵母對(duì)黑豆醬油常規(guī)理化指標(biāo)的影響。由圖2可知，外源添加酵母對(duì)醬油的全氮、還原糖和乙醇含量影響較為顯著(P<0.05)，該研究結(jié)果與宋茜等的研究結(jié)果較為一致。而酵母添加對(duì)氨基酸態(tài)氮、總酸和pH值無顯著影響(P>0.05)。其中酵母添加組全氮略高于對(duì)照組，對(duì)照組還原糖含量是酵母添加組的1.67倍，而乙醇含量是酵母添加組的12.1%，這主要是由于酵母的添加增加了對(duì)還原糖物質(zhì)的利用率，產(chǎn)生乙醇。研究表明，醬油中乙醇一方面作為代謝底物通過生物化學(xué)反應(yīng)參與酸、酯等風(fēng)味物質(zhì)的形成，另一方面借助本身易揮發(fā)、是多種有機(jī)物的良好溶劑等物理特性，在揮發(fā)呈味的過程中可將醬油中一些有機(jī)成分帶出，使得乙醇含量高的醬油在氣味上也比較香醇，從而提升感官品質(zhì)。此外，乙醇的產(chǎn)生還起到抑制雜菌、延長(zhǎng)醬油保質(zhì)期的作用，因此，本研究結(jié)果顯示酵母添加增加了黑豆醬油的品質(zhì)。

2.2 外源添加酵母對(duì)醬油游離氨基酸的影響

醬油風(fēng)味是由醬油氣味和味道組成的一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的系統(tǒng)，氣味主要指揮發(fā)性物質(zhì)被嗅覺所捕集到的信息，包括如乙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚等，味道主要指可溶性呈味物質(zhì)對(duì)觸覺和痛覺所捕集到的信息，主要指氨基酸和核苷酸類物質(zhì)如谷氨酸、IMP和GMP等。其中游離氨基酸含量高、呈味性多樣對(duì)醬油的品質(zhì)起非常重要的決定作用，如甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等呈甜味；谷氨酸、組氨酸等呈酸味；谷氨酸鈉等呈鮮味；精氨酸、蛋氨酸等呈苦味。醬油中氨基酸還參與醬油的呈色反應(yīng)，如酪氨酸、色氨酸等參與醬油黑色素的形成。因此，醬油游離氨基酸的種類和含量能夠反映醬油風(fēng)味品質(zhì)的優(yōu)劣及差異。

圖3 基于氨基酸組成的熱圖和聚類分析

通過對(duì)比不同工藝條件下黑豆醬油氨基酸含量可知，酵母添加組與對(duì)照組中游離氨基酸含量分別為(63.34±2.74)，(57.55±1.02) mg/100 g，酵母添加能夠提高游離氨基酸總含量，但無顯著影響(P>0.05)。酵母添加對(duì)黑豆醬油中谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸等有顯著影響(P<0.05)，酵母添加組谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸含量分別為(13.55±1.11)，(4.13±0.21)，(1.10±0.04)，(1.66±0.04)，(2.42±0.09) mg/100 g。對(duì)照組谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、組氨酸、精氨酸含量分別為(9.62±0.46)，(3.61±0.19)，(0.97±0.12)，(1.80±0.03)，(1.99±0.04) mg/100 g。其中，谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、精氨酸含量顯著增高，組氨酸含量顯著降低。酵母添加對(duì)蘇氨酸有極顯著影響(P<0.01)，酵母添加組和對(duì)照組蘇氨酸含量分別為(3.34±0.04)，(3.09±0.03) mg/100 g。酵母添加對(duì)其他氨基酸含量影響較小(P>0.05)。以上研究結(jié)果表明，酵母添加能夠提高醬油中游離氨基酸的含量，且對(duì)決定醬油風(fēng)味的重要游離氨基酸如谷氨酸、蘇氨酸等有顯著影響。

2.3 外源添加酵母對(duì)醬油游離氨基酸的影響

為了進(jìn)一步明確酵母添加對(duì)游離氨基酸的影響以及對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的影響，采用JMP13軟件對(duì)6個(gè)樣品的氨基酸組成進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見圖4和表1。

圖4 基于氨基酸組成的PCA分析

PCA分析結(jié)果顯示：第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為65.9%和21.4%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.3%，說明前該兩個(gè)主成分能夠充分代表樣品的整體數(shù)據(jù)信息。由圖4可知，兩種工藝條件下6個(gè)樣品雖然沒有被顯著區(qū)分成兩類，區(qū)域有一定交叉，但也表現(xiàn)出差異性，添加酵母3個(gè)樣品聚集在PC1的正半軸，第一和第四象限，且較為接近，未添加酵母的聚集在PC1的負(fù)半軸，分布在第二和第三象限，且較為接近。說明添加酵母能夠影響氨基酸的組成。

表1 主成分分析各因子載荷矩陣

由表1可知，對(duì)主成分1貢獻(xiàn)率較大的主要有天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸，且這些組分含量與酵母添加呈正相關(guān)，說明酵母的添加能夠提高這些氨基酸的含量。

3 結(jié)論

隨著對(duì)醬油發(fā)酵研究的深入，外源添加耐鹽酵母對(duì)醬油品質(zhì)的提升作用逐漸被認(rèn)知。因此，以提升醬油風(fēng)味品質(zhì)的耐鹽酵母已廣泛應(yīng)用于不同工藝醬油發(fā)酵生產(chǎn)中，并且圍繞提升醬油風(fēng)味品質(zhì)相關(guān)的酵母的菌種選育、耐鹽特性、發(fā)酵條件優(yōu)化等研究越來越多，在醬油品質(zhì)提升方面取得了顯著成效。本研究分析比較了實(shí)際生產(chǎn)過程中，酵母添加對(duì)醬油常規(guī)指標(biāo)和游離氨基酸含量的影響。結(jié)果顯示：酵母添加不僅能夠顯著性影響醬油中乙醇、總氮和還原糖含量，而且對(duì)醬油中游離氨基酸總量及氨基酸組成產(chǎn)生影響，該研究結(jié)果揭示了酵母添加對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)和味道特征方面的影響，對(duì)醬油實(shí)際生產(chǎn)及理論研究提供了理論參考。