逯曉丹，齊建勛，李俊，裴曉惠, ，陳永浩*，郝艷賓*

1. 北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院（北京 100093）；2. 北京市園林科學(xué)研究院綠化植物育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100102）；3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（青島 266109）

核桃（Juglans regiaL.）為胡桃科胡桃屬植物，是國家重點(diǎn)支持的木本糧油樹種之一，2017年全國核桃種植面積超過795萬 hm2，占木本糧油樹種種植面積的50%以上，總產(chǎn)量417萬 t[1]。核桃仁制油的副產(chǎn)物——核桃粕含有50%以上的優(yōu)質(zhì)蛋白，通過提取蛋白并對(duì)其進(jìn)行生物酶解，可以獲得具有多種活性的核桃肽，這些活性包括抗氧化活性[2-3]、降血壓活性[4-5]、降血糖活性[6-7]等。

提高具有特定活性肽的得率是酶解法制備核桃肽的研究熱點(diǎn)，在蛋白酶的選擇上，堿性蛋白酶[8]、中性蛋白酶[9]、復(fù)合蛋白酶[10-11]較其他蛋白酶更易獲得較高的短肽得率，通過蛋白酶的組合、優(yōu)化酶解參數(shù)[12-13]，同樣可以提高短肽得率，使短肽得率68%～85%[14-15]。前期研究表明，堿性蛋白酶酶解核桃蛋白，產(chǎn)物的水解度和短肽得率顯著高于其它蛋白酶處理，短肽得率可提高至85.62%[15]。作為常用預(yù)處理方法的水浴加熱、超聲波處理、微波處理，應(yīng)用在核桃蛋白等的制備中已見諸報(bào)道[14,16-17]，但通過預(yù)處理方法提高核桃肽得率的研究并不多。試驗(yàn)以木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白，采用不同預(yù)處理方法對(duì)核桃蛋白進(jìn)行預(yù)處理，考察不同預(yù)處理方法對(duì)核桃肽得率的影響，并通過單因素和正交試驗(yàn)制備感官品質(zhì)和穩(wěn)定性較好的核桃肽乳飲料，以期為核桃肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

核桃蛋白粉、核桃肽粉（實(shí)驗(yàn)室自制）；木瓜蛋白酶（生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；β-環(huán)狀糊精、蔗糖、穩(wěn)定劑等（分析純）；全脂奶粉（市售）。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型數(shù)字酸度計(jì)（上海鵬順科學(xué)儀器有限公司）；HW·SY型電熱恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表有限公司）；KDY-9830型凱氏定氮儀（北京市通潤源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司）；LXJ-IIC型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；DHG 9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；JA1003型精密電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；GJB8-15高壓均質(zhì)機(jī)（上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠）；YXA-LS-50S高壓式殺菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TDL-5臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃蛋白粉的制備[13]

取適量的核桃粕溶于水中，浸泡打漿，用1 mol/L的NaOH調(diào)pH 8.5，在55 ℃水浴鍋中攪拌1 h，在轉(zhuǎn)速3 200 r/min下離心10 min，撇去油層，提取上清液，上清液調(diào)至pH 4.5，在轉(zhuǎn)速3 200 r/min下離心20 min，獲得蛋白沉淀，用95%乙醇洗滌2次，并加入蒸餾水，調(diào)回pH 7.0，冷凍干燥備用。

1.3.2 核桃蛋白肽粉的制備

以5 g/100 mL核桃蛋白溶液經(jīng)木瓜蛋白酶在優(yōu)化條件下酶解，滅酶后冷卻，調(diào)至pH 4.5，離心取上清液，調(diào)至pH 7.0，將上清液冷凍干燥后備用。

1.3.3 不同溫度加熱預(yù)處理

配制5 g/100 mL核桃蛋白溶液，分別采用不加熱、50，60，70，80，90和100 ℃預(yù)處理15 min，冷卻，調(diào)至pH 6.5，溫度至60，加入適量的木瓜蛋白酶酶解3 h，沸水浴10 min滅酶活，冷卻，調(diào)至pH 4.5，以2 000 r/min離心5 min，取上清液，調(diào)至pH 7.0，分別測定其短肽得率。

1.3.4 不同加熱時(shí)間預(yù)處理

將5 g/100 mL核桃蛋白溶液在一定溫度下加熱預(yù)處理0，15，30，45，60，75和90 min，然后冷卻，參照1.3.3的工藝參數(shù)，采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，分別測定其短肽得率。

1.3.5 不同超聲時(shí)間預(yù)處理

對(duì)5 g/100 mL核桃蛋白溶液進(jìn)行超聲預(yù)處理，超聲波功率400 W，處理時(shí)間分別為0，2，4，6，8，10和12 min，參照1.3.3的工藝參數(shù)，采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，分別測定其短肽得率。

1.3.6 不同微波時(shí)間預(yù)處理

將5 g/100 mL的核桃蛋白溶液進(jìn)行微波預(yù)處理，微波功率800 W，加熱時(shí)間分別為0，1，2，3，4，5，6和7 min，冷卻，參照1.3.3的工藝參數(shù)，采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，分別測定其短肽得率。

1.3.7 核桃肽得率的測定[18]

稱取適量樣品于燒杯中，加入10 g/100 mL TCA 25 mL，混勻，靜置，定量轉(zhuǎn)移。離心后取全部上清液用濾紙過濾，移取濾液于消化管中，測定其氮元素含量。

短肽得率按式（1）計(jì)算。

式中：TCA-NSI為三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1為在10% TCA中可溶性氮，mg；N2為原料中的總氮，mg。

1.3.8 核桃肽乳飲料的制備

1.3.8.1 工藝流程

核桃肽粉→肽乳配比優(yōu)化→白砂糖調(diào)味→確定穩(wěn)定劑配比→均質(zhì)→灌裝→殺菌→核桃肽乳飲料

1.3.8.2 核桃肽乳飲料調(diào)味

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇肽和全脂奶粉比例分別為1∶4，1∶5和1∶6，將其混合后分別溶于飲用水中，使其質(zhì)量濃度達(dá)到8 g/100 mL，分別向其中添加白砂糖，使白砂糖濃度分別達(dá)到4，6和8 g/100 mL，充分?jǐn)嚢?，按照二因素三水平正交試?yàn)表設(shè)置9組處理，進(jìn)行感官評(píng)定打分。

1.3.8.3 感官評(píng)定方法

由10位不抽煙有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的人員，根據(jù)感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品色澤、滋味與苦味、口感、組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，滿分100分。

表1 核桃肽乳感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.8.4 核桃肽乳飲料穩(wěn)定性優(yōu)化

選用加速離心試驗(yàn)，以沉淀指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，具體方法為：向調(diào)配好的核桃肽乳飲料中按比例加入穩(wěn)定劑，混勻后，準(zhǔn)確移取25 mL至離心管中，在3 200 r/min下離心20 min，去除上部清液，準(zhǔn)確稱取底部沉淀質(zhì)量，利用式（2）計(jì)算沉淀指數(shù)。

沉淀指數(shù)=沉淀物質(zhì)量（g）/25 mL飲料質(zhì)量（g）×100% （2）

1.3.8.5 核桃肽乳飲料指標(biāo)檢驗(yàn)[19]

對(duì)核桃肽乳飲料進(jìn)行感官檢驗(yàn)、理化檢驗(yàn)和微生物學(xué)檢驗(yàn)等3個(gè)方面的檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱預(yù)處理對(duì)核桃肽得率的影響

2.1.1 加熱溫度的影響

未加熱處理的核桃蛋白由于其酶切位點(diǎn)都包藏于蛋白質(zhì)內(nèi)部，不能與蛋白酶直接接觸，使得常溫下處理的核桃蛋白酶解效果較差。適當(dāng)?shù)募訜崽幚砜墒沟鞍踪|(zhì)變性，造成蛋白分子結(jié)構(gòu)松散，三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白酶作用位點(diǎn)暴露出來，使蛋白酶作用底物濃度增大從而提高酶解速度[20]。由圖1可見，隨加熱溫度升高，短肽得率不斷提高，加熱溫度達(dá)到60℃以上時(shí)，短肽得率隨溫度升高的趨勢減緩。這可能是由于加熱溫度過高，會(huì)阻礙酶對(duì)蛋白的水解作用，隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的受熱變化，二硫鍵和疏水鍵的再生使得原松散的多肽鏈重新結(jié)合的更加緊密[20]，減少蛋白酶作用位點(diǎn)的暴露。

圖1 加熱溫度對(duì)核桃肽得率的影響

2.1.2 加熱時(shí)間的影響

70 ℃條件下對(duì)核桃蛋白進(jìn)行加熱預(yù)處理，考察加熱時(shí)間對(duì)核桃肽得率的影響。由圖2可見，加熱30 min以內(nèi)時(shí)，核桃肽得率保持在30%～40%，表明短時(shí)加熱對(duì)核桃肽得率影響不明顯。加熱45 min時(shí)，核桃肽得率達(dá)到最大值58.35%，之后隨著時(shí)間延長，核桃肽得率呈現(xiàn)逐級(jí)下降趨勢，這可能是由于適宜的加熱時(shí)間可以使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)松散，更多蛋白酶的作用位點(diǎn)暴露出來，而較長時(shí)間的加熱預(yù)處理會(huì)使暴露的蛋白酶作用位點(diǎn)減少，從而導(dǎo)致核桃肽得率降低。

圖2 加熱時(shí)間對(duì)核桃肽得率的影響

2.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)核桃肽得率的影響

由圖3可見，超聲處理1～6 min時(shí)，核桃肽得率緩慢增加，其得率均在10%以下。超聲處理7～12 min時(shí)，核桃肽得率增加速度加快，在12 min時(shí)達(dá)到最大值，為79.21%，之后隨處理時(shí)間延長，核桃肽得率呈下降趨勢。這主要是因?yàn)樵诔暡ㄌ幚砗颂业鞍走^程中，水溶液被不斷的拉伸壓縮，液體承受不了壓力時(shí)就會(huì)暫時(shí)的形成一個(gè)幾乎真空的空洞，這些空洞到達(dá)極限，崩潰時(shí)就會(huì)釋放幾萬個(gè)大氣壓的壓力，同時(shí)產(chǎn)生局部的高溫迫使蛋白質(zhì)之間的肽腱斷裂，促使酶作用位點(diǎn)暴露[20]。

圖3 超聲波處理時(shí)間對(duì)核桃肽得率的影響

2.3 微波處理時(shí)間對(duì)核桃肽得率的影響

由圖4可見，微波處理1～10 min時(shí)，核桃肽得率呈上升趨勢，前7 min核桃肽得率增加較緩慢，其得率均在10%以下，在微波處理10 min時(shí)核桃肽得率達(dá)到最大值，為96.17%。之后隨著處理時(shí)間的延長，其得率呈現(xiàn)下降趨勢。這是由于微波電場影響了蛋白質(zhì)內(nèi)部分子的熱運(yùn)動(dòng)規(guī)律，使各個(gè)分子產(chǎn)生摩擦，造成分子間的水平攪拌，從而產(chǎn)生熱量。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)分子的二硫鍵因微波的高速震動(dòng)而斷裂，使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得疏松，非極性基團(tuán)暴露，從而加快酶解速率[20]。

圖4 微波處理時(shí)間對(duì)核桃肽得率的影響

2.4 核桃肽乳飲料的配方優(yōu)化

2.4.1 核桃肽乳飲料感官性狀優(yōu)化

核桃肽具有特殊的苦味，與全脂奶粉混合可以改善這一感官性狀，同時(shí)通過適當(dāng)添加白砂糖，可以進(jìn)一步改善滋味和口感。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選用肽和全脂奶粉質(zhì)量比、白砂糖添加量2個(gè)因素，采用二因素三水平正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)組合，對(duì)每個(gè)試驗(yàn)組合進(jìn)行感官評(píng)定，感官評(píng)分見表2。肽和全脂奶粉質(zhì)量比1∶5，白砂糖添加量6%時(shí)感官評(píng)分最高。CMC、黃原膠以及單甘酯作為穩(wěn)定劑，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最佳穩(wěn)定劑配比。

表2 感官評(píng)分表

由表3極差分析結(jié)果可知，影響核桃肽乳飲料穩(wěn)定性的主次因素順序?yàn)辄S原膠＞CMC＞單甘酯，即黃原膠對(duì)核桃肽乳飲料的穩(wěn)定性影響最大，單甘酯對(duì)核桃肽乳飲料的穩(wěn)定性影響最小，核桃肽乳飲料中穩(wěn)定劑添加量分別為：CMC 0.05%，黃原膠0.05%，單甘酯0.3%。經(jīng)均質(zhì)、滅菌后，得到感官品質(zhì)和穩(wěn)定性較好的核桃肽乳飲料。

表3 核桃肽乳粉穩(wěn)定劑正交試驗(yàn)表

2.4.3 產(chǎn)品品質(zhì)

2.4.3.1 感官指標(biāo)

色澤均一，呈乳黃色；奶香味濃郁，有核桃的清香味；甜度適中可口；組織細(xì)膩，均勻無分層。

2.4.3.2 理化指標(biāo)

可溶性固形物≥9%，蛋白質(zhì)≥2.64%，總砷（以As計(jì)）≤0.2 mg/L，鉛（Pb）≤0.3 mg/L，銅（Cu）≤5.0mg/L。

2.4.3.3 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)≤100 CFU/mL，大腸菌數(shù)≤3 MPN/100 mL，致病菌不得檢出。

3 結(jié)論

對(duì)核桃蛋白進(jìn)行預(yù)處理，可有效提高酶解制備核桃肽得率。微波和超聲波預(yù)處理是提高核桃肽得率的適宜方法，經(jīng)微波處理10 min后，酶解制備核桃肽的得率可達(dá)97.18%，效果最好，超聲波處理12 min后，酶解制備核桃肽的得率為77.57%。將核桃多肽與全脂奶粉以1∶5比例混合，制成濃度8 g/100 mL的溶液，向溶液中添加白砂糖6 g/100 mL、CMC 0.05%、黃原膠0.05%、單甘酯0.3%，經(jīng)均質(zhì)、滅菌可以獲得感官品質(zhì)和穩(wěn)定性良好的核桃肽乳飲料。