范瓊，趙敏，王曉剛，鄧愛妮，葉海輝

1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心（?？?571101）；2. 海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（海口 571101）

食物中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量與人類健康有著密切的關(guān)系，硝酸鹽自身對(duì)人體危害不大，常作為食品添加劑被廣泛用于食品加工中，但它在人或動(dòng)物體內(nèi)容易被還原成亞硝酸鹽，在胃液中亞硝酸鹽容易能與次級(jí)胺合成N-亞硝胺[1]。N-亞硝胺具有很強(qiáng)的致癌性，其中有些化合物在一次劑量后即可誘發(fā)癌癥，有些甚至能穿過(guò)胎盤屏障給后代誘發(fā)腫瘤[2]。綠葉蔬菜也是膳食硝酸鹽的主要來(lái)源，可以通過(guò)硝化細(xì)菌在胃中還原成亞硝酸鹽[3]。中國(guó)的養(yǎng)生文化素來(lái)講求藥食同源，將中草藥作為膳食食材與蔬菜肉類一起烹飪，既可以保持蔬菜肉類的新鮮度和口感，又可以提高食品營(yíng)養(yǎng)安全，因此尋找安全有效清除亞硝酸鹽或抑制亞硝化反應(yīng)的中草藥已成為食品應(yīng)用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[4]。目前已有研究表明某些藥食同源的中草藥如金銀花、仙鶴草、何首烏、冰糖草、紅冬蛇菰等[5-9]均具有清除亞硝酸鹽、抑制亞硝胺合成的作用。

地膽草（Elephantopus scaberLinn.）為菊科地膽草的帶根全草，又名苦地膽、土公英、磨地膽等[10]。地膽草有涼血、清熱、解毒、利濕之功效，自古以來(lái)作為傳統(tǒng)藥物在國(guó)內(nèi)外民間被廣泛應(yīng)用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，地膽草主要含有萜類、黃酮類、甾體類等化合物[11]，具有保肝、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗高血壓、抑制黑色素等[12-13]生物活性，但是目前鮮見有地膽草清除亞硝酸鹽相關(guān)研究報(bào)道。此次試驗(yàn)以地膽草為研究對(duì)象，對(duì)其清除亞硝酸鹽效果進(jìn)行了初步探究，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定了地膽草提取物清除亞硝酸鹽的最佳條件，為地膽草進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地膽草全草，購(gòu)于海南省儋州市紅旗市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為地膽草全草。將地膽草全草洗凈晾干，置75 ℃烘箱內(nèi)烘干，研磨粉碎后過(guò)孔徑0.150 mm篩，存于干燥陰涼處，備用。

鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸、亞硝酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

植物粉碎機(jī)；SHZ-B水浴恒溫振蕩器（常州諾基儀器有限公司）；FD53熱風(fēng)循環(huán)式烘箱（德國(guó)Binder賓得公司）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AE200型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-3900紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞硝酸鹽清除率的測(cè)定

吸取2份2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于25 mL比色管中，其中1份加入10 mL地膽草提取液，另1份加入10 mL提取劑，2份搖勻反應(yīng)10 min后，均加入2 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸，搖勻反應(yīng)4 min后，加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，定容至25 mL后搖勻，在室溫下反應(yīng)15 min，以4 000 r/min離心5 min，在最大吸收波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，并以式（1）計(jì)算清除率。

式中：A0為提取溶劑和亞硝酸鈉反應(yīng)的吸光度；Ai為地膽草提取液與亞硝酸鈉反應(yīng)的吸光度；Aj為對(duì)照試驗(yàn)反應(yīng)的吸光度。

1.2.2 提取工藝對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

1.2.2.1 浸提溶劑對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

準(zhǔn)確稱取4份地膽草粉末，每份10 g，分別加入200 mL蒸餾水、80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮提取劑，室溫振蕩24 h，取出后離心過(guò)濾，所得濾液用提取溶劑定容到200 mL，即為地膽草不同提取液。按照1.2.1試驗(yàn)方法測(cè)其對(duì)亞硝酸鹽的清除效果。

1.2.2.2 料液比對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

準(zhǔn)確稱取4份地膽草粉末，每份10 g，以1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）比例量取蒸餾水，在室溫中振蕩24 h，取出后離心過(guò)濾，所得濾液用蒸餾水分別定容至100，150，200和250 mL，所得濾液為不同料液比的地膽草水提取液。按照1.2.1試驗(yàn)方法測(cè)其對(duì)亞硝酸鹽的清除效果。

1.2.3 反應(yīng)條件對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

1.2.3.1 提取液用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

分別吸取1，2，5，7和10 mL的地膽草水提取液，其余步驟按照1.2.1試驗(yàn)方法測(cè)其對(duì)亞硝酸鹽的清除效果。

1.2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

按照1.2.1的試驗(yàn)方法，分別在30，40，60，80和100 ℃下反應(yīng)15 min，在最大吸收波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定其吸光度，測(cè)定不同溫度下的亞硝酸鹽清除率。

1.2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

按照1.2.1的試驗(yàn)方法，在室溫下分別反應(yīng)15，30，45，60和120 min，在最大吸收波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定其吸光度，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間下亞硝鹽清除率。

1.2.3.4 反應(yīng)pH對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

按照1.2.1的試驗(yàn)方法，在pH分別為1.2，3和7下室溫反應(yīng)15 min，在最大吸收波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定其吸光度，測(cè)定不同反應(yīng)pH下亞硝鹽清除率。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用L9(33)正交試驗(yàn)對(duì)料液比、反應(yīng)溫度、pH進(jìn)行試驗(yàn)，研究其對(duì)地膽草清除亞硝酸鹽效果的影響，并明確其影響清除效果的主次，確定最佳反應(yīng)條件。其因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以3次試驗(yàn)的x±s表示。數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進(jìn)行單因素方差分析，p＜0.05表示顯著性差異，p＜0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

由表2可知，不同溶劑提取的地膽草提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率不同，差異性極顯著：水提取液＞80%丙酮提取液＞80%甲醇提取液＞80%乙醇提取液。地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率達(dá)到53.95%，比地膽草有機(jī)提取液清除亞硝酸鹽率高，差異性極顯著。這表明地膽草清除亞硝酸鹽的有效成分更易溶解于水提取劑中。

表2 不同溶劑對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

2.2 料液比對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

從圖1中可以看出，隨著料液比的增加，地膽草80%乙醇提取液、80%丙酮提取液、水提取液的亞硝酸鹽清除率也相應(yīng)增加。當(dāng)料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，地膽草80%乙醇提取液、80%丙酮提取液和水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為19.82%，28.00%和53.95%。料液比越高，提取液中含有的地膽草抗氧化成分越高，其清除亞硝酸鹽能力越強(qiáng)，但是成本相應(yīng)越高。

圖1 地膽草提取液料液比對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

2.3 地膽草水提取液用量對(duì)亞硝酸鹽清除效果的影響

從圖2中可以看出，隨著水提取液用量的增加，其對(duì)亞硝酸鹽的清除率增強(qiáng)。當(dāng)水提取液用量為10 mL時(shí)，地膽草對(duì)亞硝酸鹽清除率為52.90%。

圖2 地膽草水提取液用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

2.4 亞硝酸鹽用量對(duì)亞硝酸鹽清除效果的影響

從圖3中可以看出，亞硝酸鹽用量越大，地膽草水提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除效果越低。當(dāng)亞硝酸鹽用量為1 mL時(shí)，地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率為60.07%。

圖3 亞硝酸鹽用量對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除效果的影響

從圖4中可以看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為40 min時(shí)，地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率最高，為53.48%；超過(guò)40 min，地膽草對(duì)亞硝酸鹽清除效果逐漸達(dá)到平衡。

2.6 反應(yīng)溫度對(duì)亞硝酸鹽清除效果的影響

從圖5中可以看出，在30～100 ℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的增加，水提取液的亞硝酸鹽清除率小幅提升，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，水提取液的亞硝酸鹽清除率達(dá)到54.62%。溫度升高，會(huì)促進(jìn)分子運(yùn)動(dòng)速度，從而加快地膽草水提取物與亞硝酸鹽反應(yīng)速率。但是溫度過(guò)高，會(huì)破壞地膽草水提取液中的有效成分，同時(shí)部分亞硝酸鹽發(fā)生氧化作用，從而使亞硝酸鹽清除率有所下降[14]。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)地膽草水提取液亞硝酸鹽清除率的影響

2.7 反應(yīng)介質(zhì)pH對(duì)亞硝酸鹽清除率的影響

從圖6中可以看出，當(dāng)pH為1.2，3和7時(shí)，不同地膽草提取液的亞硝酸鹽清除效果不同。當(dāng)pH為1.2時(shí)，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為29.0%，35.4%和54.7%；當(dāng)pH為3時(shí)，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為19.8%，28.0%和53.9%；當(dāng)pH為7時(shí)，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為10.4%，18.8%和29.2%。結(jié)果顯示，反應(yīng)pH越低，地膽草提取液的亞硝酸鹽清除率效果越明顯，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，亞硝酸鹽易轉(zhuǎn)化為亞硝酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為N2O3，地膽草提取物可將N2O3轉(zhuǎn)化為NO，因此阻斷了亞硝胺的行程[15]。在相同的pH條件下，水提取液的亞硝鹽清除效果比其他2種有機(jī)溶劑提取液效果更好，這與表1的結(jié)果一致。

2.8 最佳反應(yīng)條件的確定

從表3中可以得出，最佳方案是A1B2C1，即料液比1∶10（g/mL），提取溫度60 ℃，pH 1.2。在此條件下，對(duì)地膽草水提取液對(duì)亞硝酸鹽清除效果為61.10%。其中因素C（pH）是影響亞硝酸鹽清除效果的最重要因素，因素A（料液比）次之，最后是因素B（反應(yīng)溫度）。

表3 地膽草清除亞硝酸鹽效果的正交試驗(yàn)表

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)關(guān)于地膽草生物活性的研究逐漸增多，溫先敏等[16]研究表明地膽草具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛效果；梁僑麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)從地膽草中分離出的兩種倍半萜內(nèi)酯化合物對(duì)人體肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞和結(jié)腸腺癌的生長(zhǎng)具有抑制作用；Su等[18]研究表明地膽草提取物可以誘導(dǎo)并激發(fā)鼻咽癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡；Wiwat等[19]研究發(fā)現(xiàn)地膽草水提取物具有抗艾滋病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性作用；范瓊等[13]研究發(fā)現(xiàn)地膽草具有降低高血壓、抗黑色素及抗氧化等生理活性，這些生理活性與地膽草含有倍半萜內(nèi)酯類、多酚類、黃酮類等活性成分息息相關(guān)。

此次試驗(yàn)測(cè)定了地膽草對(duì)亞硝酸鹽的清除能力，并通過(guò)對(duì)地膽草不同的提取工藝和反應(yīng)條件優(yōu)化對(duì)亞硝酸鹽的清除能力進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，地膽草不同溶劑對(duì)亞硝酸鹽的清除效果大小依次為水提取液、80%甲醇提取液、80%乙醇提取液、80%丙酮提取液；地膽草水提取液對(duì)亞硝酸鹽清除率為53.95%，差異性極顯著。在單一因素試驗(yàn)中，隨著料液比和地膽草提取液用量增加，地膽草清除亞硝酸鹽效果均會(huì)增強(qiáng)，當(dāng)料液比1∶10（g/mL）時(shí)，地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率為53.95%；當(dāng)?shù)啬懖菟崛∫河昧繛?0 mL時(shí)，亞硝酸鹽清除率為52.90%；而在反應(yīng)溫度30～100 ℃條件中，反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)地膽草水提取物的亞硝酸鹽清除率為最高，為54.62%，之后隨著溫度的升高，地膽草水提取物的亞硝酸鹽清除率降低，差異性極顯著。如果投入生產(chǎn)，料液比過(guò)高、提高地膽草用量以及反應(yīng)溫度均會(huì)增加前處理成本，因此選擇一個(gè)最佳提取和反應(yīng)方案非常重要。正交試驗(yàn)表明，在料液比1∶10（g/mL）、反應(yīng)溫度60 ℃、pH 1.2的條件下，地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率最高，可達(dá)到61.10%。且pH是影響地膽草清除亞硝鹽效果的最重要因素。人體胃酸pH在1.2～3左右，這表明地膽草在人體胃中可以發(fā)揮更佳清除亞硝酸鹽效果。比較于其他中草藥，例如紅冬蛇菰石油醚提取物的亞硝酸鹽清除率為59.35%[9]，蒲公英的亞硝酸鹽清除率為49.47%，珍珠菜的亞硝酸鹽清除率為20.40%[20]，說(shuō)明地膽草具有較好的消除亞硝酸鹽效果，不僅在藥品開發(fā)，而且可以在食品加工上有很好的應(yīng)用前景。