祝友朋，韓長志

西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院/云南省森林災害預警與控制重點實驗室， 昆明 650224

微生物中次生代謝產物的種類是由次生代謝合成基因簇決定的，次生代謝產物一般具有抗菌、免疫抑制、產生毒素、降低致病性等多種生物活性[1]，其作為人類疾病藥劑及農林業(yè)植物病蟲害藥劑開發(fā)的重要來源，在醫(yī)學和農業(yè)生產中發(fā)揮著重要作用。目前，國內外學者關于真菌次生代謝產物合成基因簇的研究主要集中在次生代謝產物挖掘[2]、次生代謝產物合成基因的篩選鑒定及其克隆[3]、聚酮合酶[4-5]和非核糖體肽合成酶[6-7]的作用等方面。關于細菌次生代謝產物合成基因簇的研究主要是利用antiSMASH數(shù)據(jù)庫(antibiotics & secondary metabolite analysis shell)對635個細菌的次級代謝產物合成基因簇進行注釋，發(fā)現(xiàn)40種基因簇中非核糖體肽合成酶(NRPS)、Ⅰ型聚酮合酶(T1PKS)、細菌素(bacteriocin)、萜烯(terpene)等4種基因簇在所有的細菌門中都存在，其他的基因簇存在于某個門或2個及以上的門中[8]。植物病原絲狀真菌作為侵染植物的重要微生物之一，其具有的分泌蛋白、碳水化合物活性酶以及次生代謝產物在損害植物免疫防衛(wèi)反應系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要的作用[9]。前期筆者所在研究室開展了關于植物病原絲狀真菌及細菌分泌蛋白、CAZymes預測及功能解析工作[10]，然而，關于不同營養(yǎng)類型真菌中次級代謝產物合成基因簇及不同營養(yǎng)類型真菌與次生代謝產物合成基因簇之間的關系尚不明確。

antiSMASH數(shù)據(jù)庫中關于微生物的次生代謝合成基因簇的種類共有59種，主要有聚酮合酶(PKS)、terpene和NRPS等[11]。其中，PKS能合成聚酮類化合物，主要有T1PKS、T2PKS和T3PKS，可用于研制抗生素、抗菌劑等；terpene是萜類化合物的總稱，具有重要的生物活性，是進行產物研究和新藥開發(fā)的重要來源；NRPS能合成非核糖體肽(non-ribosomal peptides,NRP)，在真菌的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，該蛋白在真菌致病過程中扮演著重要角色，由多個催化結構域組成的高度模塊化的肽合成酶，包括腺苷?；Y構域(A結構域)、巰基化結構域(T結構域)和縮合結構域(C結構域)等[12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，由蘋果斑點落葉病(Altenariaalternata)產生的AM-毒素[13]、玉米圓斑病菌(Cochlioboluscarbonum)產生的HC-毒素[14]以及玉米小斑病菌(Cochliobolusheterostrophus)[15]、水稻胡麻斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)[16]、擬南芥黑斑病菌(Alternariabrassicicola)[16]、柑橘褐斑病菌(Alternariaalternata)和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中的NPS6基因[17]以及蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)的NPS12基因均與上述病原真菌的致病性有關[18]，在實現(xiàn)NRP合成及在真菌生長發(fā)育、信號傳導及致病等過程中都發(fā)揮著重要的作用[19]。然而，不同營養(yǎng)類型植物病原真菌與不同類型次生代謝產物之間的關系尚不清楚。

本研究選擇不同營養(yǎng)類型植物病原真菌開展次生代謝產物合成基因簇的注釋工作，利用antiSMASH數(shù)據(jù)庫進行注釋分析，對比分析17種具有不同營養(yǎng)類型的植物病原菌和5種腐生營養(yǎng)型真菌的次生代謝產物合成基因簇，以期發(fā)現(xiàn)次生代謝產物合成基因簇與不同營養(yǎng)類型植物病原真菌之間的關系，為今后深入研究不同營養(yǎng)類型植物病原菌中次生代謝產物的作用機制及找尋新型藥劑作用靶標提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

選擇植物病原真菌(活體營養(yǎng)型、半活體營養(yǎng)型以及死體營養(yǎng)型)、腐生營養(yǎng)型真菌等22種真菌開展次生代謝產物預測分析。包括4種活體營養(yǎng)型真菌：玉米黑粉病菌(Ustilagomaydis)、玉米絲黑穗病菌(Sporisoriumreilianum)、小麥稈銹病菌(Pucciniagraminis)、戈洛文白粉菌(Golovinomycesmagnicellulatus)；6種半活體營養(yǎng)型真菌：小麥葉枯病菌(Zymoseptoriatritici)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、禾谷炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)、希金斯炭疽菌(C.higginsianum)、西瓜炭疽菌(C.orbiculare)和假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)；7種死體營養(yǎng)型真菌：玉蜀黍雙極蠕孢(Bipolarismaydis)、小麥葉斑病菌(Parastagonosporanodorum)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、苜蓿輪枝菌(Verticilliumalfalfae)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、葡萄孢菌(Botrytiscinerea)；5種腐生營養(yǎng)型真菌：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)、構巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、產黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。

1.2 不同真菌次生代謝產物合成基因簇差異分析

利用antiSMASH[11](https://fungismash.secondarymetabolites.org/#!/start)注釋不同營養(yǎng)類型真菌的PKS、NRPS和TPS等基因簇。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft office Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析以及Origin 9.0作圖軟件對所獲得的數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產物合成基因簇種類對比分析

對22種真菌開展次生代謝產物合成基因簇預測分析，結果發(fā)現(xiàn)5個腐生營養(yǎng)型真菌的次生代謝產物合成基因簇的種類和數(shù)量差異較大，其中釀酒酵母僅有3個次生代謝產物合成基因簇，分別是NRPS-like、terpene和含β-內酯的蛋白酶抑制劑(betalactone)；黑曲霉具有12種共63個次生代謝產物合成基因簇(圖1)。同時，在植物病原真菌中，半活體營養(yǎng)型真菌和死體營養(yǎng)型真菌的次生代謝產物合成基因簇的種類和數(shù)量都高于活體營養(yǎng)型真菌(圖1)：半活體營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產物合成基因簇種類有11～18種，數(shù)量34～76個；死體營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產物合成基因簇種類有6～11種，數(shù)量20～51個；活體營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產物合成基因簇種類有4～5種，數(shù)量6～19個。在半活體營養(yǎng)類型真菌中，次生代謝產物合成基因簇種類和數(shù)量最多的是希金斯炭疽菌；在死體營養(yǎng)類型真菌中，次生代謝產物合成基因簇種類最多的是尖孢鐮刀菌，數(shù)量最多的是玉蜀黍雙極蠕孢；在活體營養(yǎng)類型真菌中，次生代謝產物合成基因簇種類和數(shù)量最多的是戈洛文白粉菌。

2.2 不同類別次生代謝產物合成基因簇數(shù)量對比分析

進一步對不同營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產物合成基因簇的數(shù)量進行分析，結果顯示：22種真菌中編碼次生代謝產物的基因簇類型有單一型和復合型，前者有10種，后者有26種(圖2)。其中，單一型基因簇存在較多的是T1PKS、terpene、NRPS和NRPS-like等，在植物病原菌和腐生真菌中都存在(圖2A)。對不同營養(yǎng)類型植物病原菌進行分析，結果顯示，活體營養(yǎng)型植物病原菌中僅存在T1PKS、terpene、NRPS和NRPS-like基因簇，半活體營養(yǎng)型植物病原菌中存在的單一基因簇種類最多，其獨特存在betalactone、依賴tRNA的環(huán)二肽合成酶(CDPS)、鐵載體(siderophore)和Ⅲ型聚酮合酶(T3PKS)等基因簇(圖2B)。復合型基因簇存在較多的是NRPS+T1PKS、T1PKS+NRPS、吲哚(indole)+T1PKS、T1PKS+indole、NRPS-like+T1PKS和T1PKS+NRPS-like，在半活體營養(yǎng)型、死體營養(yǎng)型病原菌和腐生真菌中存在(圖2C)。

圖1 不同營養(yǎng)類型真菌次生代謝產物合成基因簇的種類(A)和數(shù)量(B)對比分析

A,B：單一次生代謝產物合成基因簇分布情況；C,D：復合次生代謝產物合成基因簇分布情況。A,B：Distribution of single primary metabolite synthesis gene cluster; C,D：Compound secondary metabolite synthesis gene cluster distribution.

此外，半活體營養(yǎng)型病原菌中存在9種獨特的復合型基因簇，分別是NRPS-like+terpene、NRPS+NRPS-like、NRPS+fungal-RiPP、NRPS+betalactone、NRPS-like+betalactone、betalactone+NRPS-like、indole+terpene、具有POP或UstH肽酶類型和修飾的真菌RiPP(fungal-RiPP)+terpene和NRPS+T1PKS+fungal-RiPP；死體營養(yǎng)型病原菌中存在6種獨特的復合型基因簇，分別是NRPS+terpene、NRPS-like+NRPS、indole+NRPS+T1PKS、T3PKS+T1PKS、terpene+T1PKS+NRPS和T1PKS+NRPS-like+other；腐生真菌存在2種獨特的復合型基因簇，分別是T1PKS+NRPS+indole和NRPS+NRPS-like+indole(圖2D)。

2.3 不同營養(yǎng)類型植物病原菌中NRPS預測分析

對17個植物病原真菌的次生代謝產物NRPS合成基因簇開展分析，結果發(fā)現(xiàn)半活體營養(yǎng)類型真菌中NRPS基因簇5～11個，NRPS基因數(shù)為7～20個；死體營養(yǎng)類型真菌中NRPS基因簇數(shù)量3～9個，NRPS基因數(shù)量2～14個；活體營養(yǎng)類型真菌中NRPS基因簇數(shù)量1～3個，NRPS基因數(shù)量1～8個(圖3)。上述結果表明，半活體和死體營養(yǎng)型病原菌中NRPS基因簇數(shù)量及NRPS基因數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型病原菌。

2.4 不同營養(yǎng)類型植物病原菌中PKS預測分析

對17個植物病原真菌的次生代謝產物PKS合成基因簇開展分析，結果發(fā)現(xiàn)半活體營養(yǎng)類型真菌中PKS基因簇數(shù)量有5～27個，PKS基因數(shù)量6～48個，但T3PKS基因簇尚未預測出其基因組成情況；死體營養(yǎng)類型真菌中PKS基因簇數(shù)量7～20個，PKS基因數(shù)量7～40個；活體營養(yǎng)類型真菌中PKS基因簇數(shù)量0～1個，PKS基因數(shù)量0～2個(圖4)。上述結果表明，半活體和死體營養(yǎng)型病原菌中PKS基因簇數(shù)量及PKS基因數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型病原菌。

2.5 不同營養(yǎng)類型植物病原菌中萜烯預測分析

對17個植物病原真菌的次生代謝產物萜烯合成基因簇開展分析，結果發(fā)現(xiàn)半活體營養(yǎng)類型真菌中萜烯基因簇數(shù)量3～12個，死體營養(yǎng)類型真菌中萜烯基因簇數(shù)量2～13個，活體營養(yǎng)類型真菌中PKS基因簇數(shù)量2～4個(圖5)。上述結果表明，半活體和死體營養(yǎng)型病原菌中萜烯基因簇數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型病原菌。

A:NRPS基因簇的數(shù)量； B:NRPS基因的數(shù)量。A：The number of NRPS gene cluster; B：The number of NRPS genes.

A:PKS基因簇的數(shù)量； B:PKS基因的數(shù)量。A：The number of PKS gene clusters; B：The number of PKS genes.

圖5 不同營養(yǎng)類型植物病原菌中所含有萜烯基因簇的數(shù)量對比情況

3 討 論

對植物次生代謝基因簇的研究發(fā)現(xiàn)其參與合成苯并噁唑嗪酮、生氰糖苷、生物堿和萜烯等化合物，與植物的生長發(fā)育有關，并參與植物的防御反應[20]。前人對病原菌次生代謝產物基因的研究集中在NRPS基因和PKS基因，發(fā)現(xiàn)玉米小斑病菌[15]、水稻胡麻斑病菌[16]、擬南芥黑斑病菌[16]、柑橘褐斑病菌和禾谷鐮刀菌中的NPS6基因[17]以及蘋果樹腐爛病菌NPS12基因均與致病性有關[18]；漸綠木霉[21]、黃曲霉[22]、大麗輪枝菌[23]和球孢白僵菌[5]的PKS基因與生長發(fā)育和侵染性有關。在植物與病原菌互作及病原菌損害植物的免疫防衛(wèi)反應系統(tǒng)方面也有許多學者進行了相關研究。如趙中濤[24]通過比較基因組的方法對94個真菌的糖類活性酶進行分析，發(fā)現(xiàn)植物病原菌中半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌中糖類活性酶的種類和數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型真菌；陳相永等[25]通過植物病原真菌寄生性與分泌蛋白組及CAZymes的比較分析，發(fā)現(xiàn)半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌分泌蛋白占全基因組序列的比例高于活體營養(yǎng)型真菌，半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌的糖基水解酶家族GH和多糖裂解酶家族PL的數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型真菌，且半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌參與植物細胞壁纖維素、木聚糖、果膠等成分降解的基因也高于活體營養(yǎng)型真菌。

本研究發(fā)現(xiàn)半活體和死體營養(yǎng)型病原菌次生代謝產物合成基因簇存在復合基因簇，而活體營養(yǎng)型病原菌中僅存在單一基因簇，但核盤菌在油菜上的營養(yǎng)類型是死體營養(yǎng)型，而在小麥上營養(yǎng)類型則是活體營養(yǎng)型[26]，由于寄主植物不同而引起其次生代謝產物合成基因簇是否存在差異性尚不清楚，有待進一步確認。此外，T3PKS基因簇僅存在于半活體和死體營養(yǎng)型病原菌中，但未發(fā)現(xiàn)該基因簇的基因組成情況，其復合基因簇和T3PKS基因簇是否與非活體寄生有關有待進一步驗證。同時，本研究對不同營養(yǎng)類型真菌的次生代謝產物合成基因簇進行對比分析，比較了NRPS基因簇、PKS基因簇和萜烯基因簇在不同營養(yǎng)類型真菌中的分布。然而，對于植物病原真菌中的次生代謝產物研究特別是對于編碼基因的功能尚不清楚，嚴重制約著人們對次生代謝產物在植物病原真菌侵染植物后所發(fā)揮的作用的認知，有待于今后開展相關生物學試驗研究。