賈莉芳 孫吉 梁潔 袁暾 連歡 馬靜 鄭利萍

【摘要】 目的 采用不同植入劑量， 對(duì)羧甲基殼聚糖（CMC）水凝膠亞慢性全身毒性試驗(yàn)劑量的選擇進(jìn)行探討。方法 設(shè)置5 ml/kg和50 ml/kg的植入劑量， 綜合臨床觀察、血液學(xué)、臨床生化、大體尸檢和組織病理學(xué)檢查結(jié)果， 對(duì)CMC水凝膠亞慢性全身毒性進(jìn)行比較研究。結(jié)果 植入劑量為50 ml/kg時(shí)， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物初期皮膚刺激損傷明顯， 試驗(yàn)終期臨床生化指標(biāo)及組織病理指標(biāo)提示受試物在該劑量條件下有潛在的亞慢性全身毒性。而植入劑量為5 ml/kg時(shí)未見明顯的亞慢性全身毒性。結(jié)論 生物材料器械亞慢性毒性評(píng)價(jià)應(yīng)遵循個(gè)體化原則， 根據(jù)產(chǎn)品的預(yù)期使用目的、使用方式、臨床最大使用劑量及前期的研究資料， 在動(dòng)物可耐受的情況下， 設(shè)計(jì)科學(xué)合理的試驗(yàn)方案對(duì)其進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

【關(guān)鍵詞】 羧甲基殼聚糖;亞慢性全身毒性;植入劑量

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.30.001

Discussion on implantation dose of carboxymethyl chitosan hydrogel in subchronic systemic toxicity test? ?JIA Li-fang， SUN Ji， LIANG Jie， et al. National Engineering Research Center for Biomedical Materials， Sichuan University， Chengdu 610064， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the implant dose of carboxymethyl chitosan （CMC） hydrogel in subchronic systemic toxicity test. Methods? ?The implantation doses of 5 ml/kg and 50 ml/kg were set， and the results of clinical observation， hematology， clinical biochemistry， autopsy and histopathology were integrated to compare the subchronic systemic toxicity of CMC hydrogel. Results? ?The skin irritation injury was obvious in the experimental animals at the initial stage. The clinical biochemical indexes and histopathological indexes at the end of the experiment indicated that the test material had potential subchronic systemic toxicity at the dose of 50 ml/kg. However， there was no obvious subchronic systemic toxicity at the dose of 5 ml/kg. Conclusion? ?The subchronic toxicity evaluation of biomaterials and devices should follow the principle of individualization. According to the expected use purpose， use mode， clinical maximum dosage and previous research data， scientific and reasonable test scheme should be designed to comprehensively evaluate the toxicity of biomaterials and devices under the condition that animals toleration.

【Key words】 Carboxymethyl chitosan hydrogel; Subchronic systemic toxicity; Implantation dose

近年來醫(yī)療器械行業(yè)飛速發(fā)展， 創(chuàng)新型、高科技產(chǎn)品層出不窮。但由于我國(guó)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)起步較晚， 傳統(tǒng)亞慢性全身毒性評(píng)價(jià)方法多借鑒化合物、藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)方法， 且多采用器械/材料的浸提液進(jìn)行評(píng)價(jià)[1-4]， 一方面樣品消耗量大， 對(duì)高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)研發(fā)企業(yè)造成了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān);另一方面試驗(yàn)期間的多次重復(fù)接觸， 不符合大多數(shù)植入性醫(yī)療器械的臨床應(yīng)用方式， 且給藥劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了臨床最大使用劑量。亞慢性全身毒性試驗(yàn)作為生物材料器械非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容， 目的是通過器械或材料可瀝濾物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)， 向人外推， 以評(píng)估其對(duì)人的危害及危險(xiǎn)性。目前醫(yī)療器械產(chǎn)品種類復(fù)雜， 不同材料器械亞慢性全身毒性試驗(yàn)的接觸方式、接觸劑量及接觸周期都各有不同， 為其長(zhǎng)期毒性的評(píng)價(jià)帶來了一定的難度。醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO TC194）WG7工作組專家Dr. Daniel McLain認(rèn)為和組織接觸的醫(yī)療器械的亞慢性全身毒性評(píng)價(jià)可以以植入的方式接觸動(dòng)物， 如引流系統(tǒng)、可吸收性止血紗布、透明質(zhì)酸凝膠、體外循環(huán)管路等[5]。羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan， CMC）是殼聚糖羧甲基化后的產(chǎn)物， 由于它既保留了殼聚糖可降解、生物相容性良好的優(yōu)點(diǎn)， 又極大地改善了水溶性[6]， 廣泛應(yīng)用于術(shù)后粘連[7]、藥物載體[8， 9]、止血材料[10]、醫(yī)用敷

料[11]、組織工程[12]等領(lǐng)域。Fu等[13]在大鼠體內(nèi)腹腔植入135 mg/kg的CMC， 14 d后測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的凝血功能、纖溶功能、抗凝性能和血液流變證實(shí)CMC經(jīng)降解吸收后對(duì)動(dòng)物血液系統(tǒng)無影響。Molinaro等[14]將

4種不同脫乙酰度的殼聚糖水凝膠注射到大鼠后爪來評(píng)價(jià)其生物相容性， 結(jié)果均引起了不同程度的炎癥反應(yīng)， 提出脫乙酰度較高的殼聚糖具有更好的生物相容性。本研究選用以戊二醛為交聯(lián)劑的CMC水凝膠為研究對(duì)象， 模擬臨床接觸途徑， 采用植入方式對(duì)其亞慢性全身毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 動(dòng)物選擇及分組 從檢疫后SD大鼠中挑選80只， 雌雄各半。稱重后隨機(jī)分為試驗(yàn)組1、對(duì)照組1、試驗(yàn)組2和對(duì)照組2， 每組每種性別各10只。

1. 2 接觸方式 術(shù)前經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（40 mg/ ml）麻醉動(dòng)物。麻醉后， 將試驗(yàn)動(dòng)物背部向上固定， 除去背部被毛， 常規(guī)消毒去毛區(qū)皮膚。在動(dòng)物背部沿脊柱兩側(cè)注射試驗(yàn)樣品或?qū)φ諛悠?。各組植入位點(diǎn)及植入劑量見表1。本試驗(yàn)周期共計(jì)90 d。

1. 3 臨床觀察 每天觀察并記錄各組動(dòng)物的一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)。包括皮膚、被毛、眼、黏膜的改變以及呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、軀體運(yùn)動(dòng)及行為模式等變化發(fā)生的時(shí)間、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間等。

1. 4 動(dòng)物體重 試驗(yàn)前稱量并記錄每只動(dòng)物體重， 植入后每周稱量1次動(dòng)物體重。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)， 即時(shí)稱量每只動(dòng)物體重。

1. 5 臨床病理 試驗(yàn)終期于腹主動(dòng)脈采血， 用于血液學(xué)和臨床生化指標(biāo)的檢測(cè)。血液學(xué)指標(biāo)包括：淋巴細(xì)胞百分比（LPR）、單核細(xì)胞百分比（MPR）、中性粒細(xì)胞百分比（GPR）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）;臨床生化指標(biāo)包括：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白球比（A/G）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、尿酸（UA）、總膽紅素（TBIL）、鉀（K）、鈉（Na）、氯（Cl）、鈣（Ca）。

1. 6 大體病理 所有動(dòng)物在試驗(yàn)終結(jié)時(shí)進(jìn)行大體尸檢， 包括檢查體表、體表孔口、頭部、胸腔、腹腔及內(nèi)臟等。及時(shí)稱量各主要臟器， 如：心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、性腺、腦、胸腺、胃等臟器的濕重并記錄各臟器的病理改變。并將器官組織置于10%中性福爾馬林溶液中， 用于組織病理學(xué)檢查。

1. 7 組織病理學(xué) 對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物的器官和組織及全部大體損害進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合臨床觀察、臨床病理、大體尸檢和組織病理學(xué)檢查結(jié)果， 分析評(píng)價(jià)受試物與異常反應(yīng)產(chǎn)生的生物學(xué)相關(guān)性。

2 結(jié)果

2. 1 臨床觀察 試驗(yàn)組1和對(duì)照組1：試驗(yàn)組1雌性大鼠在皮下注射當(dāng)天（第0天）， 各植入位點(diǎn)未見異常（見圖1-A）;皮下注射第1天， 背部大面積紅斑（見圖1-B）;皮下注射第3天， 背部紅腫明顯， 部分結(jié)痂（見圖1-C）;皮下注射第7天， 背部紅腫減輕（見圖1-D）;皮下注射第14天， 背部結(jié)痂逐步恢復(fù);皮下注射第

28天， 背部被毛長(zhǎng)出。試驗(yàn)組1雄性大鼠癥狀較輕。對(duì)照組1動(dòng)物未見異常。

試驗(yàn)組2和對(duì)照組2：試驗(yàn)組2雌性大鼠在皮下注射當(dāng)天（第0天）， 各植入位點(diǎn)未見異常;皮下注射第7天， 部分動(dòng)物植入位點(diǎn)皮膚可見輕度紅斑， 個(gè)別結(jié)痂（見圖2-A）;皮下注射第14天， 植入位點(diǎn)皮膚基本痊愈（見圖2-B）。試驗(yàn)組2雄性大鼠未見異常。對(duì)照組2動(dòng)物未見異常。

2. 2 動(dòng)物體重 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明， 各試驗(yàn)組動(dòng)物體重與同期對(duì)照組動(dòng)物體重比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。值得注意的是， 試驗(yàn)組1動(dòng)物在皮下注射第3天， 2只動(dòng)物體重下降>20 g， 16只動(dòng)物體重降幅<10 g

（試驗(yàn)數(shù)據(jù)未給出）， 但皮下注射第7天， 體重均回升。見圖3。

2. 3 血液學(xué)指標(biāo) 試驗(yàn)組1大鼠LPR低于對(duì)照組1， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;試驗(yàn)組2大鼠LPR與對(duì)照組2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;試驗(yàn)組1與對(duì)照組1、試驗(yàn)組2與對(duì)照組2大鼠WBC、MPR、GPR、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、PLT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2. 4 臨床生化指標(biāo) 試驗(yàn)組1大鼠ALT、ALP、Ca高于對(duì)照組1， AST/ALT、TP、ALB、GLB、CREA、TBIL、

Cl低于對(duì)照組1， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;試驗(yàn)組2大鼠Cl高于對(duì)照組2， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。試驗(yàn)組1大鼠AST、A/G、TG、GLU、TC、UREA、UA、K、Na與對(duì)照組1比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;試驗(yàn)組2大鼠ALT、AST、ALP、AST/ALT、TP、ALB、GLB、A/G、CREA、TG、GLU、TC、TBIL、UREA、UA、K、Na、Ca與對(duì)照組2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2. 5 大體病理 大體解剖中各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未觀察到明顯肉眼可見的損傷。試驗(yàn)組1大鼠肝臟、腎的臟器系數(shù)高于對(duì)照組1， 胸腺的臟器系數(shù)低于對(duì)照組1， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， （P<0.05）;試驗(yàn)組1大鼠心臟、脾臟、腎上腺、性腺、腦的臟器系數(shù)與對(duì)照組1比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;試驗(yàn)組2大鼠心臟、肝臟、脾臟、腎、腎上腺、性腺、胸腺、腦的臟器系數(shù)與對(duì)照組2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

2. 6 組織病理 試驗(yàn)組1多數(shù)雌性動(dòng)物局部可見肝細(xì)胞腫脹， 部分雄性動(dòng)物局部可見肝細(xì)胞腫脹， 其他臟器未見異常。見圖4。

3 討論

亞慢性全身毒性是反復(fù)或持續(xù)接觸試驗(yàn)樣品后在動(dòng)物壽命期的某一階段發(fā)生的不良作用， 可提供預(yù)期臨床途徑反復(fù)或持續(xù)接觸所產(chǎn)生的健康危害方面的信息， 以及毒性作用、靶器官、可逆性或其他作用方面的詳細(xì)信息[15]。作為一項(xiàng)生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)， 可作為重復(fù)或持續(xù)接觸人體醫(yī)療器械安全評(píng)估的重要依據(jù)。目前我國(guó)生物材料器械的亞慢性全身毒性評(píng)價(jià)主要依據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T16886.11[16]（等同轉(zhuǎn)化ISO10993-11）進(jìn)行， 但標(biāo)準(zhǔn)中僅給出了重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)的總則、試驗(yàn)設(shè)計(jì)、評(píng)價(jià)指標(biāo)和最終報(bào)告的要求， 對(duì)于具體接觸途徑， 特別是以植入為接觸途徑的接觸劑量未做詳細(xì)規(guī)定。

人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）發(fā)布的《藥物進(jìn)行人體臨床試驗(yàn)和上市許可申請(qǐng)的非臨床安全性研究指導(dǎo)原則》中認(rèn)為， 對(duì)于任何物種的急性和重復(fù)接觸毒性試驗(yàn)， 50倍的臨床接觸劑量都是可以接受的最大劑量[17]。國(guó)內(nèi)《藥物重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》中關(guān)于劑量設(shè)計(jì)給出了注釋：劑量設(shè)計(jì)應(yīng)考慮之前進(jìn)行的各項(xiàng)試驗(yàn)所評(píng)價(jià)的終點(diǎn)、受試物的理化性質(zhì)和生物利用度等。高劑量應(yīng)出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)， 或達(dá)到最大給藥量（Maximum Feasible Dose， MFD）， 或系統(tǒng)暴露量達(dá)到臨床系統(tǒng)暴露量的50倍（基于AUC）[18， 19]。

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心在技術(shù)審評(píng)中提出， 對(duì)于通過植入方式接觸受試品的亞慢性毒性試驗(yàn)， 需提供植入劑量的確定依據(jù)， 如在動(dòng)物可耐受的情況下， 推薦樣本植入劑量為擬用人體臨床劑量的50～100倍， 但是對(duì)于人與動(dòng)物間劑量的換算未做明確要求。

本研究以化學(xué)交聯(lián)法制備的CMC水凝膠為研究對(duì)象， CMC的含量為40 mg/ml， 預(yù)期用于術(shù)后粘連， 臨床最大使用劑量為10 ml。結(jié)合受試物的臨床使用及產(chǎn)品特性， 實(shí)驗(yàn)設(shè)置5 ml/kg和50 ml/kg的注射劑量， 采用植入方式對(duì)其亞慢性全身毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果表明， 植入劑量為50 ml/kg時(shí)， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物初期皮膚刺激損傷明顯， 雖后期逐漸恢復(fù)， 但試驗(yàn)終期臨床生化指標(biāo)及組織病理指標(biāo)提示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟損傷， 表明受試物在該劑量條件下有潛在的亞慢性全身毒性。而植入劑量為5 ml/kg時(shí)， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物初期僅在注射位點(diǎn)處發(fā)紅， 且試驗(yàn)終期動(dòng)物臟器無損傷， 受試樣品在該劑量條件下未見明顯的亞慢性全身毒性。同一受試物， 在不同植入劑量條件下， 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果完全不同。

藥理學(xué)家研究藥物在體內(nèi)的作用時(shí)習(xí)慣于以mg/kg或g/kg等方式來計(jì)算藥物的劑量。這種辦法適用于同種動(dòng)物的不同個(gè)體間劑量的換算。1958年P(guān)inkle氏報(bào)告6-MP等抗腫瘤藥物在小鼠、大鼠、狗和人身上的治療劑量， 改為按mg/m2體表面積計(jì)算， 此方法被認(rèn)為適用于不同動(dòng)物之間劑量的換算[20]。對(duì)于已知有潛在毒性的物質(zhì)， 相關(guān)毒代動(dòng)力學(xué)資料信息可用于種屬間的毒性比較， 其優(yōu)于簡(jiǎn)單以劑量/體重或劑量/體表面積進(jìn)行的比較[21]。本研究基于受試物的臨床最大使用劑量， 分別按照劑量/體重和劑量/體表面積換算方式設(shè)置不同的植入劑量來評(píng)價(jià)產(chǎn)品的長(zhǎng)期毒性， 得到了不同的評(píng)價(jià)結(jié)果。這就提示對(duì)于生物材料器械的毒性評(píng)價(jià)， 特別是針對(duì)長(zhǎng)期接觸醫(yī)療器械材料可瀝濾物、降解產(chǎn)物等有潛在毒性的產(chǎn)品， 要充分論證接觸劑量的選擇。ISO10993-1：2018[22]中正式給出了生物相容性的定義， 即某一醫(yī)療器械或材料在特定應(yīng)用中具有適應(yīng)宿主反應(yīng)的能力。這一定義一方面強(qiáng)調(diào)了產(chǎn)品預(yù)期用途的重要性， 另一方面指出產(chǎn)品對(duì)于宿主的反應(yīng)要適宜， 需結(jié)合器械或材料的總體設(shè)計(jì)， 兼顧安全性和有效性。隨著我國(guó)醫(yī)療器械生物學(xué)安全評(píng)價(jià)體系的日益完善， 生物學(xué)評(píng)價(jià)更多是強(qiáng)調(diào)利用已有毒理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行文獻(xiàn)評(píng)審。但醫(yī)療器械不同于化合物藥物， 其可瀝濾物中毒性物質(zhì)的含量相對(duì)較低且多為混合物， 通常缺乏完整的毒性數(shù)據(jù)， 劉成虎等[23]提出了毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）在醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)應(yīng)用中的可能性， 這為企業(yè)提交產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析提供了一個(gè)新思路。

對(duì)于植入醫(yī)療器械， 其原材料的可瀝濾物/浸提物、生產(chǎn)過程中的殘留物以及植入人體后的降解產(chǎn)物， 都將影響其終產(chǎn)品的安全性。在對(duì)生物材料器械進(jìn)行全身毒性評(píng)價(jià)時(shí)， 應(yīng)盡可能與實(shí)際臨床應(yīng)用相結(jié)合， 在動(dòng)物可耐受的條件下， 綜合考慮產(chǎn)品材料表征、實(shí)際應(yīng)用方式、接觸周期、臨床用量以及產(chǎn)品在臨床應(yīng)用中的潛在風(fēng)險(xiǎn)， 選擇合適的劑量進(jìn)行評(píng)價(jià)。企業(yè)在提交審評(píng)資料時(shí)， 應(yīng)結(jié)合檢測(cè)機(jī)構(gòu)出具的生物相容性評(píng)價(jià)結(jié)果， 按照YY/T 0316《醫(yī)療器械風(fēng)險(xiǎn)管理對(duì)醫(yī)療器械的應(yīng)用》標(biāo)準(zhǔn)的要求[24]， 對(duì)產(chǎn)品的受益-風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行全面的分析， 確保產(chǎn)品受益大于風(fēng)險(xiǎn)。

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[收稿日期：2020-08-20]