李旭妍，孫明玥，蘇 燕，楊麗麗，王亞奇，宋 芳，閆巧梅，黃世琪，閆朝麗，薩如拉，李晶晶，梁 浩，王云霞，韓家鑫，聶欣雨，劉瑞剛

糖尿病是一類(lèi)由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以慢性高血糖為特征的終身代謝性疾病，已成為繼癌癥和心血管病之后的又一嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的全球性疾病[1-3]。它的誘發(fā)因素很多，目前公認(rèn)的有遺傳、環(huán)境、生活方式及個(gè)人體質(zhì)等。紅細(xì)胞隨血液循環(huán)于全身，是最早感知血糖變化的細(xì)胞之一。近年，主要從血紅蛋白糖基化[4]、紅細(xì)胞分布寬度[5]、紅細(xì)胞膜[6]等方面針對(duì)糖尿病患者的紅細(xì)胞改變進(jìn)行了較為深入的研究，而從紅細(xì)胞能量代謝方面探索其在糖尿病及其微血管病變發(fā)生發(fā)展中作用的研究少之又少。該研究擬通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)不同濃度葡萄糖37 ℃培養(yǎng)紅細(xì)胞不同時(shí)間后，其ATP含量、己糖激酶(hexokinase,HK)活性、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性、活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量及紅細(xì)胞衰亡率的變化，闡明葡萄糖對(duì)體外紅細(xì)胞能量代謝的影響方式及其分子機(jī)制，為糖尿病微血管病變的診斷和防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料正常成人新鮮抗凝血、ATP檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0027)、ROS檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)S0033)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；Hexokinase Activity Assay試劑盒(貨號(hào)ab136957)、Pyruvate Activity Assay試劑盒(貨號(hào)ab83432)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；APC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)550474)購(gòu)自美國(guó)BD公司；葡萄糖(貨號(hào)D810588)、PBS緩沖液(貨號(hào)P854529-10EA)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1血樣采集與紅細(xì)胞制備 該項(xiàng)目由包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求每批實(shí)驗(yàn)招募18～23歲的健康志愿獻(xiàn)血者6例，并在獻(xiàn)血前與志愿者簽署知情同意書(shū)。分別采集5 ml 全血，2 000 r/min離心5 min后，去除血小板、白細(xì)胞和血漿。再用PBS清洗紅細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，去除上清液及中間的血小板和白細(xì)胞，重復(fù)洗至上清液透明。然后于無(wú)菌操作臺(tái)中將紅細(xì)胞重懸于PBS，使紅細(xì)胞壓積達(dá)到45%左右。將制備好的懸浮紅細(xì)胞輕輕混勻后分為4組(每組1 ml，重復(fù)3次)，分別向其中加入D-葡萄糖，使其終濃度分別為0、6、20、30 mmol/L。輕輕混勻，37 ℃震蕩水浴培養(yǎng)48 h。分別于培養(yǎng)期24和48 h, 輕輕混勻EP管中的懸液，無(wú)菌抽取200 μl 紅細(xì)胞懸液，分別進(jìn)行以下指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2ATP含量檢測(cè) 取紅細(xì)胞懸液60 μl，2 000 r/min，離心5 min，棄上清液。輕輕彈散紅細(xì)胞，取5 μl 紅細(xì)胞加入到200 μl Buffer中制成溶血液。取4 μl溶血液加入到100 μl檢測(cè)液及16 μl裂解液中，利用多功能酶標(biāo)儀的luminometer功能測(cè)定各孔的相對(duì)光單位(relative luminometer units，RLU)值并計(jì)算結(jié)果。

1.2.3HK活性檢測(cè) 取紅細(xì)胞懸液60 μl，2 000 r/min，離心5 min，棄上清液。輕輕彈散紅細(xì)胞，取10 μl制成溶血液，再取20 μl溶血液加入到80 μl檢測(cè)液，室溫避光放置20 min后，利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的光密度(optical density,OD)值并計(jì)算結(jié)果。

1.2.4PK活性檢測(cè) 取紅細(xì)胞懸液40 μl，2 000 r/min，離心5 min，棄上清液。輕輕彈散紅細(xì)胞，取10 μl制成溶血液，再取2 μl溶血液加入到98 μl檢測(cè)液中，室溫避光放置10 min后，利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處各孔的OD值并計(jì)算結(jié)果。

1.2.5ROS檢測(cè) 取紅細(xì)胞懸液20 μl，2 000 r/min，離心5 min，棄上清液。輕輕彈散紅細(xì)胞，取1 μl 紅細(xì)胞加入到按照1 ∶1 000用PBS緩沖液稀釋的DCFH-DA(500 μl)中，室溫避光孵育30 min，然后3 500 r/min，離心5 min，棄上清液。加500 μl PBS緩沖液洗紅細(xì)胞，重復(fù)3次，加入300 μl PBS緩沖液重懸紅細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS含量。

1.2.6紅細(xì)胞衰亡檢測(cè) 取紅細(xì)胞懸液20 μl，2 000 r/min，離心5 min，棄上清液。輕輕彈散紅細(xì)胞，取1 μl 紅細(xì)胞加入到100 μl工作液中(100 μl的1×Binding buffer與0.5 μl Annexin V-FITC和APC的混合液)，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響在不同濃度葡萄糖組，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各不同濃度葡萄糖組紅細(xì)胞內(nèi)ATP含量呈波動(dòng)式下降，其中0 mmol/L組紅細(xì)胞內(nèi)ATP含量下降最為顯著，6 mmol/L組僅48 h變化明顯，與對(duì)應(yīng)濃度組的0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0 mmol/L組：F=2 715.43，P<0.01；6 mmol/L組：F=22.05，P<0.01)，而20、30 mmol/L組變化幅度較小，與對(duì)應(yīng)組的0 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20 mmol/L組：F=9.34，P>0.05；30 mmol/L組：F=9.45，P>0.05)。從培養(yǎng)時(shí)間看，培養(yǎng)24、48 h后，紅細(xì)胞內(nèi)的ATP含量均隨著葡萄糖濃度增加而不斷升高，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的0 mmol/L比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24 h：F=24.03，P<0.01；48 h：F=6.41，P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響

2.2 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)HK活性的影響在不同濃度葡萄糖組，隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，各不同濃度葡萄糖組紅細(xì)胞內(nèi)HK活性不斷下降，其中0和6 mmol/L組下降幅度較大，與對(duì)應(yīng)濃度組的0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0 mmol/L組：F=38.25，P<0.05；6 mmol/L組：F=13.66，P<0.05)，而20和30 mmol/L組僅48 h與對(duì)應(yīng)濃度組的0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20 mmol/L組：F=6.93，P<0.05；30 mmol/L組：F=7.09，P<0.05)；而在培養(yǎng)24、48 h后，紅細(xì)胞內(nèi)HK活性均隨著葡萄糖濃度的增加而增高，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的0 mmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24 h：F=14.4，P<0.05；48 h：F=6.72，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)HK活性的影響

2.3 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)PK活性的影響在不同濃度葡萄糖組，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各不同濃度葡萄糖組紅細(xì)胞內(nèi)PK活性不斷下降，其中0和6 mmol/L組下降幅度比較大，與對(duì)應(yīng)濃度組的0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0 mmol/L組：F=125.21，P<0.05；6 mmol/L組：F=29.61，P<0.05)，而20和30 mmol/L組下降趨勢(shì)不明顯，與對(duì)應(yīng)濃度組的0 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20 mmol/L組：F=2.81，P>0.05；30 mmol/L組：F=2.07，P>0.05)；而在培養(yǎng)24、48 h后，紅細(xì)胞內(nèi)的PK活性隨著葡萄糖濃度的增加而穩(wěn)步上升，30 mmol/L組與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的0 mmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24 h：F=5.09，P<0.05；48 h：F=4.04，P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)PK活性的影響

2.4 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響在不同濃度葡萄糖組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各不同濃度葡萄糖組紅細(xì)胞內(nèi)ROS含量呈上升趨勢(shì)，其中0 mmol/L組變化最為明顯，6 mmol/L組僅48 h與對(duì)應(yīng)濃度組的0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0 mmol/L組：F=10.79，P<0.05；6 mmol/L組：F=8.73，P<0.05)；在培養(yǎng)24、48 h后，紅細(xì)胞內(nèi)ROS的含量隨葡萄糖濃度增加而降低，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的0 mmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24 h：F=10.74，P<0.05；48 h：F=8.44，P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

2.5 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞衰亡率的影響在不同濃度葡萄糖組，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各不同濃度葡萄糖組紅細(xì)胞的衰亡率不斷上升，但各不同濃度組僅48 h變化最為顯著，與對(duì)應(yīng)濃度組的0 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0 mmol/L組：F=28.5，P<0.05；6 mmol/L組：F=24.19，P<0.05；20 mmol/L組：F=22.19，P<0.05；30 mmol/L組：F=7.22，P<0.05)，0 mmol/L組由于能量供應(yīng)不充足，紅細(xì)胞衰亡率上升尤其顯著；在培養(yǎng)24、48 h后，紅細(xì)胞衰亡率隨葡萄糖濃度增加而下降，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的0 mmol/L組比較，僅48 h的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.66，P<0.05)，見(jiàn)表1、圖5。

表1 不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞衰亡率的影響

3 討論

糖尿病微血管病變是糖尿病特有的一種并發(fā)癥，其主要表現(xiàn)為血管基底膜病變和微循環(huán)異常[7]。微循環(huán)異常除血流動(dòng)力學(xué)改變外主要體現(xiàn)在紅細(xì)胞方面。紅細(xì)胞變形能力和生理功能的正常是保證微循環(huán)的必要條件。早在20世紀(jì)60年代就有文獻(xiàn)提出維系紅細(xì)胞形態(tài)需要ATP提供能量，紅細(xì)胞變形能力與紅細(xì)胞代謝活性密切相關(guān)[8]。葡萄糖在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的作用下易化擴(kuò)散進(jìn)入紅細(xì)胞，在紅細(xì)胞內(nèi)，約90%的葡萄糖進(jìn)行糖酵解，其余10%進(jìn)入磷酸戊糖途徑，因此糖酵解是紅細(xì)胞獲得ATP的唯一途徑。HK和PK是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，調(diào)控著ATP生成的速率和量，對(duì)維持紅細(xì)胞形態(tài)和功能起到至關(guān)重要的作用。有研究[9-11]表明糖尿病患者紅細(xì)胞內(nèi)HK和PK活性高于正常人。本研究結(jié)果表明，短期葡萄糖體外孵育的條件下，隨著葡萄糖濃度增加，紅細(xì)胞內(nèi)ATP含量逐漸增高，HK和PK活性也不斷增高。據(jù)此推測(cè)，紅細(xì)胞外葡萄糖濃度越高，易化擴(kuò)散進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖越多，關(guān)鍵酶活性越高，產(chǎn)生的ATP越多。然而HK和PK活性均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，可能與紅細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的逐漸消耗減少及體外細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)。也有研究[12]報(bào)道葡萄糖經(jīng)糖酵解代謝時(shí)產(chǎn)生的代謝中間物6-磷酸葡萄糖增加到一定量時(shí)會(huì)抑制HK活性，這也可能是引起紅細(xì)胞內(nèi)HK活性隨時(shí)間延長(zhǎng)下降的原因之一。此外，胞外葡萄糖濃度越高，進(jìn)入胞內(nèi)的糖量越多。與6 mmol/L組比較，胞內(nèi)ATP含量明顯增高，說(shuō)明高濃度葡萄糖代謝產(chǎn)生的過(guò)量ATP，也可能反饋性抑制HK和PK活性。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度葡萄糖對(duì)紅細(xì)胞衰亡的影響

在人體血液中，紅細(xì)胞是數(shù)量最多的血細(xì)胞。紅細(xì)胞運(yùn)輸氧氣的功能使其不斷與細(xì)胞內(nèi)外的氧自由基接觸，且其細(xì)胞膜上含有豐富的不飽和脂類(lèi)，因此紅細(xì)胞極易受到氧自由基的氧化損傷。已有研究證實(shí)[9]，長(zhǎng)期慢性高血糖會(huì)引起ROS過(guò)度產(chǎn)生或積累，進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的病理改變，例如微血管及大血管異常。其原因主要是由于高濃度葡萄糖使內(nèi)源性ROS形成增加，激活Ca2+通道，導(dǎo)致紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，并直接激活鈣敏感的K+通道。這進(jìn)一步導(dǎo)致紅細(xì)胞膜發(fā)生超極化而使K+離子泄漏，從而提高了Cl-排出的電驅(qū)動(dòng)力[13]。最后，KCl隨胞液從細(xì)胞中滲出，使細(xì)胞體積減少以及膜完整性喪失，細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸外翻，繼而引起紅細(xì)胞衰亡的發(fā)生。Vitak et al[14]報(bào)道葡萄糖自氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化以及Amadori產(chǎn)物和晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成是糖尿病患者紅細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生的主要原因。本研究結(jié)果顯示，與6 mmol/L組比較，高糖組紅細(xì)胞內(nèi)ROS及衰亡率均降低，說(shuō)明短時(shí)間內(nèi)高糖尚不能引起紅細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激進(jìn)而引起細(xì)胞衰亡。短期高糖培養(yǎng)減少ROS的原因可能是由于進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖增多會(huì)通過(guò)磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的更多的NADPH，進(jìn)而增加抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽的生成，阻止了ROS的過(guò)度產(chǎn)生；亦或是穩(wěn)定的糖基化終末產(chǎn)物還未形成，自由基形成少，不能引起紅細(xì)胞氧化損傷。與此相反，0 mmol/L組紅細(xì)胞內(nèi)ROS和衰亡率均較其他組高，說(shuō)明能量匱乏可以刺激紅細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致紅細(xì)胞衰亡。