徐 璇，湯其強(qiáng)

PTEN蛋白是10號(hào)染色體上的磷酸酶，是胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的初級(jí)磷酸酶[1]，通過降低PI3K的磷酸化，減少信號(hào)通路蛋白激酶B(protein kinase B，PI3K)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達(dá)，參與細(xì)胞的增長(zhǎng)、分化等多種功能[2]。研究[3]表明PTEN蛋白在腦缺血損傷后氧化增加，導(dǎo)致自噬通路PI3K/AKT/mTOR表達(dá)的增強(qiáng)，從而加重腦損傷。減少PTEN蛋白的氧化，對(duì)腦組織的保護(hù)具有重要意義。故尋找抑制PTEN氧化的新型藥物至關(guān)重要。丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，TSA)是植物丹參的提取物，具有活血化瘀、清除氧自由基等功效，在臨床上常作為心腦血管疾病患者的治療用藥[4]。研究[5]表明TSA具有明確的調(diào)節(jié)自噬通路PI3K/AKT從而保護(hù)腦組織的作用。但是TSA對(duì)PTEN/PI3K信號(hào)通路的調(diào)節(jié)暫無研究。該研究擬探討TSA調(diào)節(jié)PTEN對(duì)大鼠腦缺血后自噬通路PI3K/AKT/mTOR的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料TSA購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，配比濃度為10 mg/kg[6]，術(shù)前連續(xù)灌胃4 d；6月齡健康雄性SD大鼠共80只，體質(zhì)量230～280 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下喂養(yǎng)。PTEN(9188T)、AKT(4691T)、mTOR(3983T)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；PI3K(ab151549)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,濃度均為1 ∶1 000。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)將SD大鼠分為假手術(shù)組(10只)和手術(shù)組(70只)。假手術(shù)大鼠作為對(duì)照組標(biāo)記為NC組；手術(shù)組大鼠再進(jìn)行隨機(jī)分兩組，即給TSA藥組(TSA組)和給生理鹽水組(MCAO組)。根據(jù)大鼠拔線天數(shù)(1、3、7 d)不同，分別將手術(shù)組中TSA組第1天標(biāo)記為T1，第3天標(biāo)記為T3，第7天標(biāo)記為T7;MCAO組分別對(duì)應(yīng)為M1、M3、M7。

1.2.2腦缺血模型 根據(jù)Longa et al[7]線栓法制作大鼠腦缺血模型。手術(shù)操作簡(jiǎn)述：10%水合氯醛麻醉，在大鼠頸部正中線處切1～2 cm切口，分離出大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。從頸外動(dòng)脈近頸總動(dòng)脈分叉處切一小口，插入魚線，魚線至頸內(nèi)動(dòng)脈深入距約2 cm感覺有阻力時(shí)，即已插至大腦中動(dòng)脈，阻斷中動(dòng)脈血流，達(dá)成栓塞條件。在栓塞2 h后拔魚線。根據(jù)不同組的要求，在拔線后1、3、7 d進(jìn)行斷頭取腦。

1.2.3行為學(xué)評(píng)分 參照Longa et al[7]方法進(jìn)行評(píng)分：0分：活動(dòng)正常、無任何神經(jīng)功能異常者；1分：不能完全伸展左側(cè)前爪者；2分：爬行見向左側(cè)追尾轉(zhuǎn)圈；3分：行走見身體向左側(cè)傾倒、偏癱；4分：不能自發(fā)行走且有意識(shí)障礙；納入者為1～3分。

1.2.4免疫組織化學(xué) 取完整腦組織，石蠟包埋，切片。用30 %過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶；山羊血清封閉非特異性蛋白；孵抗體；DAD顯色；復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.2.5Western blot 斷頭取腦，選擇梗死側(cè)腦組織進(jìn)行徹底勻漿提蛋白，確保組織完全裂解后收集上清液，即蛋白總?cè)芤?。配制SDS-PAGE電泳、上樣、轉(zhuǎn)模、孵抗體，曝光后將圖片存檔，用ImageJ軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 Longa評(píng)分對(duì)造模成功的大鼠，根據(jù)Longa評(píng)分，對(duì)納入統(tǒng)計(jì)的TSA組和MCAO組大鼠的行為學(xué)進(jìn)行評(píng)分統(tǒng)計(jì)。通過觀察對(duì)手術(shù)組大鼠的行為評(píng)分，從而間接表達(dá)大鼠神經(jīng)功能受損情況。其中TSA組大鼠的行為學(xué)評(píng)分較MCAO組低(F=89.76，P<0.05)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 各組大鼠的行為學(xué)評(píng)分情況

2.2 免疫組化檢測(cè)各蛋白表達(dá)水平免疫組織化學(xué)切片染色顯示：與NC組比較，手術(shù)組的各蛋白表達(dá)水平明顯改變：PTEN減少，PI3K、AKT、mTOR表達(dá)水平增加，隨著時(shí)間變化逐漸恢復(fù)；手術(shù)組中TSA組的PTEN表達(dá)增加，PI3K、AKT、mTOR表達(dá)降低。見圖2。

2.3 Western blot檢測(cè)各蛋白的表達(dá)與NC組比較，MCAO組PTEN蛋白表達(dá)減少，PI3K、AKT、mTOR表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與MCAO組比較，TSA組PTEN蛋白表達(dá)增加，PI3K、AKT、mTOR表達(dá)降低，第1天最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FPTEN=79.829,FPI3K=77.423,FAKT=42.400,FmTOR=27.896,P<0.05)，見圖3。

3 討論

隨著研究的不斷擴(kuò)展，研究者發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白在神經(jīng)領(lǐng)域也不斷出現(xiàn)[8-9]：PTEN對(duì)神經(jīng)細(xì)胞及腦組織的再生有影響，且PTEN蛋白的表達(dá)增加對(duì)缺血損傷后的組織具有保護(hù)作用。在腦缺血后激活自噬通路PI3K/AKT/mTOR，能夠加重腦組織的損傷，但是關(guān)于自噬信號(hào)的激活機(jī)制目前說法不一。隨著對(duì)蛋白PTEN的研究逐步加深，發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白具有磷酸酶活性，能夠促進(jìn)PI3K的磷酸化，能夠調(diào)節(jié)自噬通路的表達(dá)，對(duì)信號(hào)通路PI3K/AKT/mTOR具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究中，在大鼠發(fā)生腦缺血后，PTEN蛋白的表達(dá)減少，尤其是第1天較為明顯，隨時(shí)間變化逐漸回升，而自噬蛋白PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表達(dá)明顯增加，在第1天出現(xiàn)峰值，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)水平逐漸恢復(fù)正常，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在大鼠發(fā)生腦缺血后，機(jī)體PTEN蛋白的表達(dá)受抑制，從而減少PI3K的磷酸化，激活自噬通路PI3K/AKT/mTOR表達(dá)，加重腦組織損傷，驗(yàn)證了腦缺血后PTEN蛋白的氧化能夠激活自噬信號(hào)通路PI3K/AKT/mTOR，PTEN蛋白具有調(diào)控自噬通路PI3K/AKT/mTOR的作用。

圖2 梗死側(cè)腦組織細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色 ×200

圖3 Western blot 檢測(cè)各組PTEN、PI3K、 AKT、 mTOR蛋白表達(dá)與NC組比較：*P<0.05;與MCAO組比較：#P<0.05

TSA作為臨床常用藥物，在保護(hù)腦缺血方面具有肯定療效。作為中藥，TSA的治療機(jī)制暫無全面了解。前期的研究[4]發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血發(fā)生后，TSA通過調(diào)節(jié)自噬通路PI3K/AKT/mTOR的表達(dá)，減輕腦組織損傷，從而起到護(hù)腦的作用。關(guān)于TSA如何下調(diào)PI3K/AKT/mTOR的表達(dá)，目前暫無研究說明。本研究在TSA組的大鼠腦缺血發(fā)生后，PTEN蛋白的表達(dá)雖然呈下降趨勢(shì)，但與MCAO組比較，幅度明顯小，PI3K/AKT/mTOR蛋白表達(dá)的增加趨勢(shì)較小，再一次驗(yàn)證了TSA有下調(diào)自噬信號(hào)通路表達(dá)的作用。而TSA能夠促進(jìn)PTEN蛋白的表達(dá)，從而通過減輕自噬通路PI3K/AKT/mTOR的過度表達(dá)，減輕腦缺血后導(dǎo)致的腦組織損傷。再結(jié)合大鼠的行為學(xué)評(píng)分，TSA組的行為學(xué)評(píng)分較MCAO組低，在手術(shù)后第1天明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明TSA治療大鼠腦缺血具有臨床意義。