曹軍，陳鑫琪，張文龍

(1.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210019；2.江蘇省南京環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210013；3.河海大學，江蘇 南京 210098)

河流底質的微生物是河流生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)及水體凈化的驅動力，且微生物對水環(huán)境變化較為敏感，常被作為指示生物用于監(jiān)測和反映水質情況[1]，例如富營養(yǎng)化導致的生態(tài)環(huán)境條件惡化可造成微生物多樣性下降[2]。而水環(huán)境的污染也可造成底質微生物群落多樣性降低和導致特定功能菌群產生相應變化[3-4]?，F通過解析長江南京段入江支流底質的不同營養(yǎng)級微生物群落組成、α及β多樣性，探討平水期和豐水期不同支流的底質微生物群落的結構組成差異，以期為長江南京段入江支流的生態(tài)保護和環(huán)境監(jiān)測提供科學依據。

1 研究方法

1.1 研究區(qū)概況

長江南京段自安徽省東部流入，橫貫南京市，下接鎮(zhèn)揚河段。岸線全長近200 km，平均水深>15 m，江面寬闊[5]。北岸上起浦口區(qū)駟馬山河口，迄六合大河口，長約93 km，有駟馬山河、石磧河、高旺河、七里河、京新引水河、石頭河、岳子河、劃子口河、滁河六合段等入江支流。南岸上起江寧區(qū)，迄棲霞大道河口，長約98 km，有牧龍河、江寧河、工農河、板橋河、秦淮新河雨花段、外秦淮河、金川河、北十里長溝東支、九鄉(xiāng)河、七鄉(xiāng)河、三江河、大道河等支流[6]。

1.2 采樣時間

結合流域內降水特征及水文節(jié)律特點[7-8]，于2019年平水期(4月)及豐水期(9月)采集底質樣品。

1.3 采樣點位

采樣點位分別為：X1B、X2B、X7B、X11B、X13B、X25B、X3A、X6A、X8A、X10A、X12A、X15A—X17A、X19A、X20A，X22A、X24A、X26A—X28A，見圖1。

圖1 采樣點位

1.4 樣品采集

采集的底質樣品用無菌的50 mL聚丙烯管收集，所有的樣品被儲存在干冰盒里，并隨后轉移到-80℃的冰箱里保存用于DNA提取。

1.5 DNA提取、擴增及測序

使用土壤DNA快速提取試劑盒(Fast Soil DNA Kit)快速提取沉積物樣品中的DNA。通過1% 瓊脂凝膠進行電泳檢測提取的DNA是否質量合格。將提取的合格的DNA模板送至上海凌恩生物科技有限公司進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，PCR儀為ABI GeneAmp 9700型，擴增的具體條件見表1。擴增子熒光定量均一化后在Illumina HiSeq 4000平臺上進行配對測序。

表1 PCR擴增引物及反應條件

1.6 生物信息分析流程

測序得到的原始數據存在一定比例的干擾數據，為了提升分析序列的質量，分析前要先對測序產生的原始序列進行過濾處理，得到優(yōu)化序列。

(1)序列比對和操作分類單元(OTU)分析：用Flash軟件 (v1.2.7) 對>75%擴增子長度的Illumina雙端原始讀數進行條形碼和引物裁剪，并進行組合。然后使用QIIME v.1.9.1將測得的序列按照序列相似性為97%的閾值進行OTU聚類；

(2)物種分類：使用PyNAST比對算法與 Silva v128 參考數據庫比較獲得細菌分類數據，與Silva v132參考數據庫比較獲得原生和后生動物分類數據；

(3)微生物群落多樣性分析：使用PAST3軟件，分析每個分類單元的相對豐度分布，從而計算樣品中的微生物多樣性指數。

2 結果與分析

2.1 底質細菌群落組成

21條主要入江支流42個底質樣品的優(yōu)化序列數為61 696，可歸屬于62個門，選取平均相對豐度前10位的菌門作為優(yōu)勢門。平水期入江支流底質樣品中的優(yōu)勢門包括：變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等(圖2a)。其中，變形菌門(Proteobacteria)平均相對豐度最高，占51.56%，綠彎菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Bacteroidetes)各占9.99%、9.19%。豐水期底質樣品中的優(yōu)勢門包括：變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)等(圖2b)。其中變形菌門(Proteobacteria)平均相對豐度最高，占51.98%，酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)各占8.67%、8.33%、5.01%。豐水期與平水期相比，底質的細菌優(yōu)勢門在種類上基本一致；數量上，酸桿菌門(Acidobacteria)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對豐度分別上升1.29%和2.23%，擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Phylum Firmicutes)各下降3.08%、1.66%和1.15%。

圖2 入江支流底質樣品在門水平上的細菌群落組成

樣品優(yōu)化序列可歸屬于285個綱，選取平均相對豐度前20的菌綱作為優(yōu)勢綱。平水期入江支流底質樣品的優(yōu)勢綱包括：β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)等(圖3a)。其中，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)的平均豐度最高，達到19.08%；γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)次之，平均豐度占14.35%；δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)各占12.13%、5.81%、4.52%，梭菌綱(Clostridia)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)、硝化螺旋菌綱(Nitrospirae)各占3.01%、2.99%、2.78%。豐水期底質樣品的優(yōu)勢綱在組成上與平水期一致(圖3b)。而在數量上存在明顯的水期差異：平水期相對豐度最高的β-變形菌綱(Betaproteobacteria)的優(yōu)勢地位在豐水期被δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)所取代，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)相對豐度下降3.09%；厭氧繩菌綱(Anaerolineae)相對豐度下降2.50%；硝化螺旋菌綱(Nitrospirae)相對豐度上升2.23%。

β-變形菌綱(Betaproteobacteria)包含了固氮細菌，為沉積物提供了更強的固氮能力，是富營養(yǎng)化沉積物的主導微生物，適合生活在較高富營養(yǎng)化的水環(huán)境中[9]。硝化螺旋菌綱(Nitrospirae)具有氨氧化和硝化作用，促進氮循環(huán)[10-11]；厭氧繩菌綱(Anaerolineae)屬于兼性厭氧細菌(anaerobic bacteria)，也具有反硝化功能[12]。因此結合本研究中不同水期各優(yōu)勢菌綱的數量變化可見，豐水期入江支流底質環(huán)境的硝化作用可能得到加強，而固氮和反硝化作用有所減弱；且相比平水期的底質環(huán)境溶氧較高，水體富營養(yǎng)化程度較低。王毛蘭[13]和魏靜等[14]的相關研究分別表明豐水期水體的富營養(yǎng)化水平和氨氮濃度相較平水期和枯水期較低，與文章分析結果一致。

圖3 入江支流底質樣品在綱水平上的細菌群落組成

2.2 細菌群落多樣性

Shannon指數綜合考慮群落的豐富度和均勻度，其數值越大，表明群落結構的復雜程度和穩(wěn)定性越高，生物多樣性越高[15-16]。而生物多樣性是河流生態(tài)系統(tǒng)平衡和河流系統(tǒng)健康的基礎[17]，常被用作監(jiān)測和預測一個水生生態(tài)系統(tǒng)健康與否的標準[18]。HU等[19]曾比較多種生物指數和多樣性指數對明珠湖水質評價的結果，提出采用Shannon指數能較準確對該湖的水質進行評價?，F采用Shannon指數表征入江支流底質微生物群落的復雜程度和穩(wěn)定性，以及河流生態(tài)系統(tǒng)健康的程度。見表2。

表2 入江支流底質樣品的細菌、原生動物和后生動物的Shannon指數

由表2可見，平水期細菌Shannon指數數值為5.803～7.608，豐水期Shannon指數數值為5.767～7.488，均值分別為6.828和6.899。Shannon指數明顯較低的點位有X3A(北十里長溝東支，豐水期)、X20A(石頭河，平水期)、X27A(板橋河，平水期)、X17A(七里河，平水期)等。同時基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析(NMDS，見圖4)表明，平水期和豐水期的樣品群落組成呈現比較明顯的差異；平水期X2B(金川河)、X20A(石頭河)與豐水期X13B(高旺河)的底質樣品細菌群落的結構組成與同水期的其他點位差異較大。NMDS結合置換多元方差分析(ADONIS，p= 0.047 < 0.05)表明入江支流底質細菌群落組成在平水期與豐水期具有差異。底質樣品的理化性質檢測分析結果顯示硝酸鹽氮、總磷(TP)和總有機碳(TOC)在平水期和豐水期存在顯著差異(獨立樣本t檢驗，p< 0.05)，而平水期金川河、石頭河的底質TOC含量遠高于其他點位，表明入江支流底質環(huán)境在不同水期存在差異。

圖4 不同水期各采樣點底質樣品的非度量多維尺度分析(NMDS)

2.3 底質原生動物和后生動物群落組成

選取平均相對豐度較高的原生動物及后生動物作為優(yōu)勢種群，基于Bray-Curtis距離算法對樣本距離矩陣進行聚類分析，構建樣本層級聚類樹與群落結構堆積圖組合形式展現，見圖5(a)(b)。原生動物中，不等鞭毛類(Stramenopiles)、囊泡蟲類(Alveolata)和綠色植物(Chloroplastida)為主要優(yōu)勢類群，相對豐度分別為42.31%，27.96%和16.86%。后生動物中，節(jié)肢動物(Arthropoda)、輪蟲(Rotifera)和線蟲(Nematoda)為主要的優(yōu)勢類群，相對豐度分別占27.19%，17.56%和14.16%。聚類分析表明，平水期X2B(金川河)、X16A(劃子口河)、X28A(秦淮新河)和豐水期X2B(金川河)、X8A(三江河)、X11B(駟馬山河)與同水期其他點位的相似性很低，相對獨立。說明這些河流底質的原生及后生動物群落構成與其他河流差異較大。

圖5 入江支流底質樣品的原生動物及后生動物在的群落組成

2.4 原生動物和后生動物多樣性

底質樣品中原生動物和后生動物的Shannon指數結果見表2。21個采樣點中14個采樣點的樣品原生動物多樣性在豐水期高于平水期，Shannon指數數值為0.640～5.308，平水期和豐水期的均值分別為4.046和4.178；平水期和豐水期中分別有X2B(金川河)和X6A(九鄉(xiāng)河)、X17A(七里河)的原生動物多樣性顯著低于其他點位，金川河采樣點尤其顯著。另一方面，12個采樣點的后生動物多樣性豐水期高于平水期；Shannon指數數值為0.369～2.984，平水期和豐水期的均值分別為2.013和1.906；平水期和豐水期中分別有X17A(七里河)、X11B(駟馬山河)和X25B(牧龍河)的后生動物多樣性明顯低于其他點位。

原生及后生動物的多樣性往往與污染物濃度呈負相關[20]，即水環(huán)境的污染程度越高，原生動物和后生動物的多樣性越低。由表2可見，整體上平水期的原生及后生動物的多樣性較低，表明平水期入江支流的底質生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相對較差、水體污染程度整體上可能稍嚴重于豐水期；而金川河、七里河、牧龍河等河流的水污染可能尤為嚴重。金川河作為南京市重要入江支流且包含省控斷面，其流域主要覆蓋老城區(qū)，人口密集[21]，長期存在水質不達標、水環(huán)境惡化等問題。雖然近年來相關部門對入江支流進行了水環(huán)境整治，但以上分析表明金川河、七里河、石頭河等入江支流底質的多營養(yǎng)級微生物多樣性較低，水生態(tài)系統(tǒng)可能不夠穩(wěn)定。

3 結論

(1)長江南京段入江河流底質多營養(yǎng)級微生物優(yōu)勢種與國內其他區(qū)域河流組成類似。細菌的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)等，優(yōu)勢菌綱為β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)等。原生動物和后生動物中優(yōu)勢類群分別為不等鞭毛類(Heterknta)、囊泡蟲類(Alveolata)和節(jié)肢動物(Arthropoda)、輪蟲(Rotifera)等。

(2)細菌優(yōu)勢綱中硝化螺旋菌綱(Nitrospirae)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)等在相對豐度上的水期差異顯示豐水期入江支流底質環(huán)境相比平水期有較高的硝化作用、溶氧較高而反硝化作用減弱，進一步表明豐水期入江支流的富營養(yǎng)化水平和氨氮濃度比平水期較低。

(3)細菌、原生動物、后生動物多營養(yǎng)級的群落結構組成和多樣性分析結果表明，入江支流不同水期的微生物組成存在顯著差異，豐水期的多營養(yǎng)級微生物多樣性整體上高于平水期。