原芳芳 王麗 劉偉 吳松芳 郭紅延

近年來，脂肪來源間充質(zhì)干細胞(adipose stem cells，ADSCs)因易于獲取、增殖能力強且具有多向分化能力等優(yōu)點[1]，而成為骨組織再生的重要細胞來源[2]。但如何在復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境中有效控制干細胞遞送、生存、增殖及分化仍然面臨挑戰(zhàn)，干細胞的療效受到一系列因素的影響，其中局部炎性微環(huán)境起到關(guān)鍵性作用[3-4]。

巨噬細胞是炎癥免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。根據(jù)功能和表面抗原的不同，巨噬細胞分為促炎M1型和抗炎M2型兩種亞群。M1型巨噬細胞分泌大量促炎因子和趨化因子，主要發(fā)揮宿主免疫清除功能；M2 型巨噬細胞分泌多種細胞因子，在促進組織修復(fù)方面有重要作用[5]。越來越多的研究表明，不同亞型的巨噬細胞分泌的細胞介質(zhì)對干細胞的募集、增殖和分化具有不同影響[6-8]。但是其對ADSCs細胞行為有何影響的相關(guān)文獻還未見報道。

本實驗利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和干擾素γ(interferon-gamma，IFN-γ)刺激巨噬細胞向M1亞型極化；利用白介素4(interleukin，IL-4)刺激巨噬細胞向M2亞型極化[9]，得到含不同炎性因子的條件培養(yǎng)基來模擬不同的炎性微環(huán)境，分析比較CM1、CM2對ADSCs增殖和分化方面的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

α-MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Gibco，美國);磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京索萊寶);細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)(Dojindo，日本);茜素紅染色液、油紅O染色液(Cyagen，美國)；APC標記抗小鼠F4/80流式抗體、PE標記抗小鼠CD206、CD86流式抗體、紅細胞裂解液(Biolegend，美國);LPS(Sigma，美國);巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF); IFN-γ、重組小鼠IL-4(Peprotech，美國);CD206抗體、CD86抗體(Abcam，英國)。

1.2 小鼠骨髓源性巨噬細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

取C57BL/6小鼠，無菌分離雙側(cè)股骨、脛骨，用RPMI-1640培養(yǎng)基沖出骨髓于50 ml離心管中。加入2 ml紅細胞裂解液混勻后靜置5 min，終止反應(yīng)后300 g離心5 min。隨后用含20 ng/ml M-CSF、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10%FBS以及1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)8 d后使用CD68(M1型巨噬細胞表面標志物)檢測細胞形態(tài)，使用流式細胞術(shù)檢測F4/80(巨噬細胞表面標志物)表達率，分析所得巨噬細胞純度。

1.3 巨噬細胞的極化刺激與鑒定

所得細胞培養(yǎng)8 d后，更換M1型或M2型極化刺激液，培養(yǎng)24 h即得到M1、M2型巨噬細胞。M1型極化刺激液由LPS(100 ng/ml)、IFN-γ(20 ng/ml)、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素以及RPMI-1640培養(yǎng)基配置；M2型極化刺激液由重組小鼠IL-4(20 ng/ml)、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素以及RPMI-1640培養(yǎng)基配置。使用CD86以及CD206(M2型巨噬細胞表面標志物)檢測細胞形態(tài)，使用流式細胞術(shù)檢測F4/80+細胞中CD86+或CD206+的比例，分析不同極化類型巨噬細胞純度。

1.4 收集條件培養(yǎng)基

極化刺激24 h后，更換不含刺激液的培養(yǎng)基再孵育24 h。因間充質(zhì)干細胞對巨噬細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用[10-12]，應(yīng)更換前使用PBS清洗兩遍，以確保除去刺激因子。收集上清液并以1 950g離心20 min。然后通過0.22 μm針氏濾器過濾以除去細胞和碎片。將所得條件培養(yǎng)基分裝后于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離培養(yǎng)ADSCs

取SD大鼠，無菌分離腹股溝處脂肪，剪碎并加入4 ml 0.25%EDTA-胰酶、1 ml Ⅳ型膠原酶、1 ml dispase酶以及4 ml H-DMEM，15 min后終止消化并將已過濾的細胞懸液移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸細胞并接種至培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.6 CCK-8法檢測ADSCs的增殖

將ADSCs接種于96孔板，待細胞貼壁后，更換為CM1、CM2或新的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)5復(fù)孔。檢測時每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育3 h。隨后使用酶標儀立即測定450 nm處的吸光度值(A)。

1.7 成骨誘導(dǎo)ADSCs分化及檢測

將ADSCs接種于6孔板，待細胞貼壁后，更換含有成骨誘導(dǎo)劑(0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)的CM1、CM2或完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)14 d后，進行茜素紅染色并使用Image J軟件對結(jié)果進行半定量分析。

1.8 成脂誘導(dǎo)ADSCs分化及檢測

將ADSCs接種于6 孔板，待細胞貼壁后，更換含有成脂誘導(dǎo)劑(1 μmol/L氫化可的松、0.5 μmol/L異丁基甲基黃嘌呤、10 ng/ml胰島素、1 μmol/L地塞米松)的CM1、CM2或完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)14 d后，進行油紅O染色并使用Image J軟件對結(jié)果進行半定量分析。

1.9 成骨、成脂分化相關(guān)基因的RT-PCR檢測

3 組ADSCs經(jīng)成脂或成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，在14 d時提取各組細胞總RNA，進行RT-PCR檢測。成骨相關(guān)基因引物為Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(related transcription factor 2，RUNX2)、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)以及特異性AT富集序列結(jié)合蛋白2(specific AT enrichment sequence binding protein 2，SATB2)，成脂標志基因引物為成脂過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gama，PPAR-γ)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα)。引物序列見表 1。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細胞形態(tài)觀察及鑒定

免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD68+的細胞形狀多樣，呈不規(guī)則型，有偽足；核為卵圓形、腎形或不規(guī)則形，偏于細胞一端，呈現(xiàn)典型的巨噬細胞形態(tài)(圖 1A)；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示F4/80的陽性表達率為99.2%(圖 1B),成功獲得小鼠骨髓來源的巨噬細胞。

表 1 RT-PCR 引物序列

圖 1 巨噬細胞表型鑒定

2.2 巨噬細胞刺激極化后檢測極化效果

免疫熒光染色結(jié)果顯示巨噬細胞極化后形態(tài)發(fā)生變化，向M1型極化的巨噬細胞呈“煎蛋樣”，偽足較短(圖 2A)；而向M2型極化巨噬細胞偽足較細長，呈“細長紡錘樣”[13](圖 2C)。流式細胞術(shù)分析顯示F4/80+細胞中CD86+的比例約為90.7%(圖 2B)；F4/80+細胞中CD206+的比例約為90.1%(圖 2D)。

圖 2 不同類型巨噬細胞表型鑒定

圖 3 3 組ADSCs增殖曲線

2.3 ADSCs增殖的檢測

CCK-8檢測結(jié)果顯示培養(yǎng)1 d，3 組之間A值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)3 d，CM2組A值顯著低于CM1和Norm組(P<0.001)，CM1和Norm組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)5、7 d，CM1組A值均顯著高于CM2和Norm組(P<0.001)，即CM1組細胞增殖量最高，CM2組最低(圖 3)。

2.4 ADSCs成骨分化的檢測

茜素紅染色結(jié)果顯示3 組均觀察到礦化結(jié)節(jié)生成，呈分散狀；半定量分析顯示CM2組中的ADSCs產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量顯著高于其他2 組(P<0.05)(圖 4)。RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CM2組RUNX2、OCN、SATB2的相對表達量均明顯高于其他2 組(P<0.001)。CM1組與Norm組相比，RUNX2相對表達量Norm組高于CM1組(P<0.001)，而OCN、SATB2表達量2 組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖 5)。

2.5 ADSCs成脂分化的檢測

油紅O染色結(jié)果及半定量分析顯示成脂誘導(dǎo)14 d后CM1組中的ADSCs相比其他2 組產(chǎn)生了更多的脂滴(P<0.05)(圖 6)。RT-PCR分析顯示，CM1組PPAR-γ、C/EBPα mRNA相對表達量均明顯高于其他2 組(P<0.01)。PPAR-γ相對表達量Norm組低于CM2組(P<0.001)，而C/EBPα表達量2 組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖 7)。

圖 4 3 組ADSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色以及半定量分析結(jié)果

圖 5 3 組ADSCs成骨誘導(dǎo)后相關(guān)基因的表達結(jié)果

圖 6 3 組ADSCs成脂誘導(dǎo)后油紅-O染色以及半定量分析結(jié)果

圖 7 3 組ADSCs成脂誘導(dǎo)后相關(guān)基因的表達結(jié)果

3 討 論

He等[14]研究者使用不同亞型RAW264.7細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)，結(jié)果表明基于M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基促進BMMSCs的成骨分化潛能，還增強了其細胞片層的形成能力。Lu 等[15]將M0、M1和M2 3 種亞型巨噬細胞與BMMSCs直接共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)雖然所有巨噬細胞亞型均增強骨形成，但是M1型的增強作用最大，其主要機制可能是促炎型M1巨噬細胞通過環(huán)氧酶-2-前列腺素E2途徑促進BMMSCs成骨。本實驗中結(jié)果與該結(jié)論存在一定的差異，可能的原因是共培養(yǎng)過程中單核細胞和其他細胞因子的參與。由于各研究中所用巨噬細胞的來源、刺激方案及共培養(yǎng)方式的不同，可能導(dǎo)致它們對促進MSCs成骨作用的相關(guān)性在不同生理條件下有所改變[16-18]。

本實驗發(fā)現(xiàn)CM1組中的ADSCs誘導(dǎo)成脂效果最好，而CM2組中的ADSCs誘導(dǎo)成脂效果在一定程度上受到抑制。Cao等[19]將巨噬細胞與MSCs共培養(yǎng)后觀察到MSCs的成脂分化能力被明顯抑制，局部微環(huán)境主要誘導(dǎo)RAW246.7巨噬細胞向M2表型發(fā)生極化，其主要機制是CXCR2通過改變p38/ERK-Elk1信號傳導(dǎo)途徑的活化來調(diào)節(jié)MSC的脂肪形成分化。與本實驗結(jié)論一致，巨噬細胞與MSCs之間的相互作用在巨噬細胞極化和MSCs脂肪分化調(diào)控中有著重要影響。但是目前對于極化巨噬細胞條件培養(yǎng)基對ADSCs脂肪形成分化的影響研究報道較少，具體機制尚還需進一步研究。

總之，本實驗證實CM1可以增強ADSCs的增殖潛力和成脂分化能力；CM2顯著增強了ADSCs成骨能力。研究結(jié)果可為基因治療及干細胞移植治療后，干細胞在不同微環(huán)境下的行為學(xué)判斷以及治療預(yù)后評估提供參考。