王佳 宋向欣 蘇旭 陳曉濤

2型糖尿病(diabetes mellitus type II，T2DM)占全部糖尿病的90%以上，其本質(zhì)是一種與免疫系統(tǒng)激活密切相關(guān)的全身性低度慢性炎癥狀態(tài)[1]。牙周炎是糖尿病的第六大并發(fā)癥[2]。慢性牙周炎(chronic peridontitis，CP)是發(fā)生于牙周支持組織的感染性疾病，T2DM與CP的雙向關(guān)系在過去的幾十年中得到了廣泛的研究，二者都與炎癥增強和免疫反應(yīng)受損有關(guān)[3-4]。T輔助細胞17(T helper cells 17，Th17)/調(diào)節(jié)性T細胞 (regulatory T cells，Treg)平衡在多種炎癥性和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，本研究通過檢測健康人、單純T2DM患者、T2DM伴不同程度牙周炎患者外周血中的Th17、Treg及其相關(guān)細胞因子的水平及與牙周狀態(tài)的關(guān)系，初步闡明 Th17/Treg 細胞比例失衡在T2DM伴CP中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 病例選擇及分組 納入2018 年5 月～2019 年5 月就診于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院患者共88 例，分為健康對照組(Ⅰ組)：隨機抽取該院體檢中心的健康志愿者21 例；單純T2DM組(Ⅱ組)：收集在該院內(nèi)分泌科住院確診為單純T2DM且未合并牙周炎的患者25 例，符合1999 年WHO關(guān)于2型糖尿病的診斷標準[5]；T2DM合并牙周炎組：收集該院內(nèi)分泌科住院確診的T2DM合并牙周炎患者，T2DM的診斷標準同上，CP的診斷標準符合2012 年美國CDC疾控中心制定的分類標準[6]，分為T2DM伴輕度牙周炎(Ⅲ組)22 例以及T2DM伴中重度牙周炎(Ⅳ組)20 例患者。受試者知情同意，研究方案經(jīng)倫理委員會批準(編號： 國自然2016029)。

1.1.2 診斷標準 1999年WHO關(guān)于2型糖尿病的診斷標準[5]，即空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖(2hPG)≥11.1 mmol/L；根據(jù)2012 年美國CDC疾控中心關(guān)于CP的分類標準[6]，即輕度CP：≥2 個鄰面位點CAL≥3 mm和≥2 個鄰面位點PD≥4 mm(不在同一顆牙上)或1 個鄰面位點(PD≥5 mm)；中度CP：≥2 個鄰面位點CAL≥4 mm(不在同顆牙上)，或≥2 個鄰面位點PD≥5 mm(不在同顆牙上)；重度CP：≥2 個鄰面位點CAL≥6 mm(不在同顆牙上)和≥1 個鄰面位點PD≥5 mm。因重度牙周炎病例數(shù)較少，本研究將中度與重度牙周炎，合并為中重度CP組。

1.1.3 納入標準 ①口內(nèi)余留牙不少于20 個；②近半年內(nèi)未行牙周治療，3 個月內(nèi)未服用抗生素或非甾體類抗炎藥物；③接受正規(guī)治療，采用口服降糖藥物或注射胰島素治療，近期病情無變化。

1.1.4 排除標準 ①合并嚴重的肝腎功能不全者；②合并感染性疾??；③惡性腫瘤患者；④自身免疫性疾病患者；⑤吸煙者(按WHO關(guān)于吸煙調(diào)查方法標準規(guī)定每天吸煙1支以上，持續(xù)吸煙1 年以上為吸煙者)。

1.2 主要試劑及儀器

抗人CD3、CD4、IL-17A、CD25、CD127單克隆抗體(Biolegend公司，美國)；佛波酯(PMA)、離子霉素(IO)、蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(BFA)(Biogems公司，美國)；淋巴細胞分離液(天津華科生物有限公司)；人IL-17、TGF-βELISA試劑盒(R&D公司，美國)；FACS Canto TMII流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.3 方法

1.3.1 牙周指標檢查 對全部受試者行牙周檢查，每顆牙均做頰、舌側(cè)的遠中、正中和近中6 個位點記錄，統(tǒng)一使用Williams牙周探針，檢測PD、BI。6 個位點的PD和BI平均值即為每個牙的結(jié)果，受檢牙的平均值即為患者的結(jié)果。同時拍攝曲面斷層片，輔助診斷。

1.3.2 外周血中Th17、Treg水平的檢測 分離PBMC：清晨空腹采集受檢者外周靜脈血4 ml，肝素抗凝，離心取血漿，-80 ℃保存待測。經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。Th17檢測：將PBMC轉(zhuǎn)移至24 孔板中，使用刺激物佛波酯(PMA)和離子霉素(IO)1 h后，放入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(BFA)，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，刺激細胞活化，并設(shè)置同型對照組，然后標記CD3、CD4抗體，破膜孵育后標記IL-17A抗體，測定Th17細胞百分比。Treg檢測：在PBMC中分別標記CD4、CD25、CD127抗體，避光孵育20 min后，PBS清洗，離心棄上清，重懸細胞，上流式儀器檢測。

1.3.3 血清中IL-17、TGF-β檢測 將血清按照酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)說明書檢測IL- 17、TGF-β，酶標儀測定450 nm 吸光度值，繪制標準曲線，計算細胞因子實際濃度。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 一般資料及臨床參數(shù)

各組間年齡、性別均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，3 組間的糖尿病病程、收縮壓、舒張壓、 總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、體重指數(shù)(BMI)、25羥基維生素D測定均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。與Ⅰ組、Ⅱ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組的PD、BI更高(P<0.05)，與Ⅲ組相比，Ⅳ組的PD更高(P<0.05)(表 1)。

2.2 外周血中Th17、Treg的變化

圖 1A圈出部分表示淋巴細胞及CD3+CD4+T細胞亞群，圖 1C表示淋巴細胞及CD4+CD25+T細胞亞群。與Ⅰ組相比，其他3 組中Th17細胞比例明顯較高(P<0.05)，且Ⅳ組較其他3 組更高(P<0.05)(圖 1B和l圖 2A)；與Ⅰ組相比，其他3 組Treg細胞比例明顯較Ⅰ組更低(P<0.05)，但3 組間無顯著差異(P>0.05)(圖 1D、圖 2B)；與Ⅰ組相比，其他3 組Th17/Treg比值明顯較Ⅰ組更高(P<0.05)，其中Ⅳ組較Ⅱ組的Th17/Treg比值更高(P<0.05)(圖 2C)。

表 1 研究人群的臨床和人口統(tǒng)計參數(shù)

圖 1 每組中單個患者的Th17(CD3+CD4+IL-17A+), Treg(CD4+CD25+ CD127-) 細胞典型流式圖

圖 2 各組Th17、Treg細胞比例及Th17/Treg比值

圖 3 各組IL-17、TGF-β水平

2.3 各試驗組血清中 IL-17、TGF-β的變化

與Ⅰ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組的 IL-17濃度更高(P<0.05)，且Ⅳ組的 IL-17濃度比Ⅱ組也更高(P<0.05)(圖 3A)。而TGF-β的濃度各組間沒有明顯差異(P>0.05)(圖 3B)。

2.4 Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17、TGF-β與 PD，BI的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Th17、Th17/Treg比值、IL-17與PD呈正相關(guān)(r=0.599 0、0.519 9、0.335 1，P<0.05)(圖 4)，Th17、Th17/Treg比值、IL-17與BI呈正相關(guān)(r=0.288 6、0.296 2、0.267 4，P<0.05)(圖 5)。

3 討 論

大量研究證實，牙周炎和糖尿病之間存在雙向關(guān)系，但其機制仍沒有得到充分的闡述，越來越多的研究關(guān)注到牙周炎與糖尿病的免疫炎癥反應(yīng)機制。

圖 4 Th17，Treg，Th17/Treg 與PD的相關(guān)性分析

圖 5 Th17，Treg，Th17/Treg 與BI的相關(guān)性分析

CD4+淋巴細胞是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的主要細胞，在T2DM伴CP的發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用。淋巴細胞可分為Th1/Th2兩個亞群，Th17細胞是2005 年被新發(fā)現(xiàn)的一類有促炎作用CD4+T細胞亞群，特征性地分泌IL-17，而Treg對炎癥和自身免疫則有抑制作用，Th17和Treg在炎癥和自身免疫病中的作用相互拮抗[7]。本研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，其他3 組的Treg細胞比例均顯著降低，說明T2DM患者免疫負調(diào)節(jié)的能力低于正常人，與李大偉等[8]的研究一致，但有無牙周炎對于T2DM患者的Treg細胞比例無顯著影響。Treg細胞主要通過細胞依賴的抑制作用或者釋放細胞因子如 IL-10、TGF-β等發(fā)揮抗炎作用[9]，本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β濃度在T2DM患者與健康對照組間均沒有明顯差異，說明T2DM合并CP時沒有明顯的炎癥抑制作用。與健康對照組和單純T2DM組相比，T2DM伴中重度CP患者的Th17比例和Th17/Treg比值明顯升高，說明T2DM合并中重度CP患者體內(nèi)存在明顯Th17/Treg失衡，而這種免疫失衡可能主要是由于炎癥Th17細胞數(shù)量增高所致。與Zeng等[10]的研究一致，其認為Treg/Th17或Treg/Th1比例降低有助于免疫激活和炎癥的增強，從而引起T2DM的并發(fā)癥。說明了Th17/Treg免疫失衡在T2DM伴CP中的作用。

Th17可通過特異性分泌IL-17發(fā)揮促炎作用，IL-17是一種強有力的促炎細胞因子，與受體結(jié)合，可產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，引起炎性細胞浸潤和組織損傷[11]。本課題組前期研究證明了Th17/IL-17參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展[12]，鄧秋艷等[13]的研究表明IL-17可能是牙周炎發(fā)生重要促炎細胞因子，糖尿病可能通過Th17 細胞亞群共同發(fā)揮致病作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，單純T2DM組的Th17細胞比例及IL-17濃度明顯升高，說明T2DM患者的高血糖狀態(tài)可刺激IL-17等炎性因子的激活和釋放，引起牙周組織破壞和牙槽骨吸收，而增加糖尿病患者牙周炎發(fā)生的可能性及嚴重性。T2DM伴中重度CP的Th17比例及血清中IL-17濃度明顯升高，說明中重度CP加重了Th17 誘導的炎癥反應(yīng)，提示牙周袋內(nèi)的IL-17可能通過牙周袋潰瘍面進入血液循環(huán)，從而增加糖尿病的患病風險和血糖控制難度。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Th17、Th17/Treg比值、IL-17與PD、BI均呈正相關(guān)(P<0.05)，說明牙周炎的嚴重程度與免疫失衡程度相關(guān)。與王建琪等[14]的研究一致，說明牙周炎患者機體免疫功能降低，IL-17與牙周炎發(fā)生發(fā)展相關(guān)。進一步證明了Th17/IL-17在T2DM和CP雙向關(guān)系中的作用。

由此可以推測牙菌斑中的細菌及其產(chǎn)物作為始動因子可能觸發(fā)機體的免疫反應(yīng)，從而促使Th17細胞的分化并分泌IL-17，激活破骨細胞和分泌 MMPs，導致牙槽骨的吸收和結(jié)締組織破壞；同時，IL-17與受體結(jié)合通過多種信號通路，可引起胰島素抵抗，或在其他介質(zhì)的協(xié)同作用下參與破壞胰島β細胞，促進T2DM的發(fā)生發(fā)展。T2DM和CP兩者互為因果，相互影響，形成惡性循環(huán)，而在這過程中Th17、Th17/Treg比值及IL-17發(fā)揮了重要作用。

本研究表明Th17/Treg失衡可能參與了T2DM伴CP的發(fā)生發(fā)展過程，表明了T2DM和CP之間的雙向關(guān)系，也可能成為免疫治療的潛在靶點。