許亮 劉姍姍 周小芬 馬勝男 朱小峰

缺氧或低氧是實體腫瘤重要的微環(huán)境特征之一，在缺氧微環(huán)境下缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)高度表達，在維持細胞氧穩(wěn)態(tài)中起重要作用[1]。HIF-1是一種轉錄因子，它是由HIF-1α和HIF-1β組成的異二聚體。HIF-1α蛋白在常氧條件下迅速降解，并在低氧條件下穩(wěn)定，而HIF-1β蛋白組成型表達。HIF-1α已被認為與葡萄糖轉運，糖酵解，癌細胞增殖/存活和腫瘤微血管等多種生物代謝途徑存在密切關聯(lián)[2]。為進一步探討HIF-1α對口腔鱗癌細胞的相關作用機制，本實驗通過基因沉默技術，研究HIF-1α基因對口腔鱗癌細胞凋亡及周期的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人口腔鱗癌TSCCA細胞(中國科學院上海細胞生物研究所)；RPMI-1640培養(yǎng)基、青/鏈雙抗、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(HyClone公司，美國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；缺氧誘導劑(CoCl2)、CCK-8試劑盒、Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；Bcl-2、Bax、Caspase-3、PARP、CDK1/2、cyclin A、cyclin B、p21、β-actin單克隆抗體、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(Santa Cruz公司，美國)；ECL化學發(fā)光試劑(Thermo公司，美國)；多功能酶標儀(BioTek公司，美國)；AI600化學發(fā)光成像系統(tǒng)(GE公司，美國)；流式細胞儀(Bekman Coulter公司，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人口腔鱗癌TSCCA細胞接種于含10%胎牛血清，1%青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為飽和濕度，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。采用100 μmol/L CoCl2處理細胞模擬缺氧環(huán)境[3]。當細胞融合度達到70%～80%時，用0.25%的胰蛋白酶將細胞消化后進行傳代培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期的細胞開展后續(xù)實驗。

1.3 構建HIF-1α基因沉默口腔癌細胞系

取處于對數(shù)生長期的人口腔鱗癌TSCCA細胞，用胰酶-EDTA混合液消化后制成單細胞懸液接種于6 孔板中，使每孔細胞數(shù)量保持在1×104個放入37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞滿度達到40%時加入濃度為5 μg/ml的聚乙烯培養(yǎng)液2 ml，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，然后從培養(yǎng)箱中拿出細胞，將慢病毒感染也置于冰上緩慢溶解，根據(jù)上海吉凱基因技術公司的慢病毒感染說明書(GV115載體)，向六孔板中加入1×107TU/ml濃度的病毒液量進行細胞感染；放入培養(yǎng)箱12 h后，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；之后可通過熒光顯微鏡觀察細胞的綠色熒光強度，此時感染成功的細胞內(nèi)有綠色熒光表達，待細胞融合度達到70%進行細胞傳代。然后換上含適當濃度的嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)液進行篩選，最終獲得穩(wěn)定轉染的細胞株。

將細胞分為正常對照組(未處理TSCCA細胞)；陰性對照組(轉染無關基因序列的TSCCA細胞)；基因沉默組(轉染HIF-1α反義基因序列的TSCCA細胞)。

1.4 細胞存活率檢測

收集處于對數(shù)生長期的TSCCA細胞，調(diào)整細胞懸液的濃度，96孔板里每孔加入100 μl細胞懸液，使3 組細胞數(shù)約為1×104個/孔。缺氧處理細胞12, 24, 48 h后，加入10 μl CCK-8，在細胞培養(yǎng)箱孵育4 h，用酶標儀測量吸光度(A450)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組A450值-空白調(diào)零組A450值)/(對照組A450值-空白調(diào)零組A450值)。

1.5 細胞凋亡檢測

把處于對數(shù)期的TSCCA細胞以200 μl/孔接種至6 孔板，孵育12～16 h。待細胞融合度65%～75%時，3 組細胞缺氧處理24 h。加入200 μl T/E消化后，收集細胞懸液至tube管中，使用Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒，根據(jù)附帶的說明書檢測細胞凋亡情況，利用流式細胞儀進行檢測。重復3 次實驗。

1.6 細胞周期

收集3 組TSCCA細胞懸液，按細胞周期檢測試劑盒說明書進行操作，并用流式細胞儀對細胞周期進行檢測。實驗重復3 次。

1.7 Western blot檢測相關蛋白表達

收集不同處理組的TSCCA細胞懸液，提取蛋白，SDS-PAGE分離，轉膜，封閉(5%脫脂乳)，一抗孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，加入ECL化學發(fā)光試劑顯色，通過化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測，內(nèi)參采用β-actin。數(shù)據(jù)用Image J圖像分析軟件進行蛋白定量分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 HIF-1α基因沉默口腔癌細胞系的構建

GV115載體與軟件設計的HIF-1α反義序列(表 1)及無義序列經(jīng)過酶切連接后，獲得重組的慢病毒載體，然后用其感染TSCCA細胞。如圖 1，細胞呈規(guī)則圓形，大小均勻，排列致密整齊，生長狀態(tài)良好；并且綠色熒光顯示感染率超過70%。接下來通過添加嘌呤霉素進行篩選，獲得穩(wěn)定轉染細胞株后，通過Western blot檢測HIF-1α蛋白表達情況。如圖 2，缺氧培養(yǎng)24 h后，基因沉默組HIF-1α蛋白含量顯著低于其他兩處理組，而正常對照組和陰性對照組之間無顯著性差異(P<0.05)，表明穩(wěn)定轉染的HIF-1α基因沉默口腔癌細胞系構建成功。

表 1 HIF-α基因沉默序列

2.2 HIF-1α基因沉默對TSCCA細胞增殖的影響

通過CCK-8對缺氧處理12、24、48 h后TSCCA細胞的增殖活性進行了檢測。如圖3所示，隨著缺氧處理時間的增加，3 組細胞的增殖活性均受到一定程度的抑制；而缺氧處理12 h后，3 組細胞的增殖抑制率未見顯著性差異；當缺氧處理24 h后，基因沉默組的增殖活性受到顯著抑制(P<0.05)；但是缺氧處理時間達到48 h，基因沉默組的增殖抑制率超過60%，因此，后續(xù)實驗采用的缺氧處理時間為24 h。

圖 1 重組慢病毒轉染TSCCA細胞 (×400) 圖 2 沉默HIF-1α基因對TSCCA細胞HIF-1α蛋白的表達影響

圖 3 沉默HIF-1α基因對缺氧TSCCA細胞增殖的影響

2.3 HIF-1α基因沉默對TSCCA細胞凋亡的影響

為探究HIF-1α基因與細胞凋亡的內(nèi)在關聯(lián)，通過流式細胞術對各處理組的細胞凋亡情況進行了檢測。正常對照組的細胞凋亡率為17.14%±2.15%，陰性對照組為19.67%±1.88%，兩者差異無統(tǒng)計學意義；而基因沉默組顯著上升，高達53.12%±4.67%，與正常對照組和陰性對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖 4)。通過Western blot對凋亡相關蛋白的表達量進行檢測。與正常對照組和陰性對照組相比，基因沉默組細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及PARP表達量明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著下降(P<0.05)(圖 5)。

2.4 HIF-1α基因沉默對TSCCA細胞周期的影響

為探討HIF-1α基因沉默與細胞周期的相關性，通過流式細胞術對各處理組細胞周期進行檢測。正常對照組和陰性對照組的細胞周期未見明顯異常，而基因沉默組被阻滯在G2/M期；與兩對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)(圖 6)。此外，HIF-1α基因沉默組的G2/M期蛋白CDK1/2、Cyclin A、Cyclin B蛋白表達量減少，而CDK抑制因子p21增加，與正常對照組和陰性對照組相比，差異有顯著性(P<0.05)(圖 7)。

圖 4 沉默HIF-1α基因對TSCCA細胞凋亡的影響

圖 5 沉默HIF-1α基因對TSCCA細胞凋亡相關蛋白表達的影響

3 討 論

口腔癌是發(fā)病于頰黏膜、上下齦、硬腭、舌和口底的惡性腫瘤，主要以鱗狀細胞癌為主，全球每年新增患者超過20 萬人，而我國口腔癌的發(fā)病率及死亡率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[4]?？谇击[癌是血液供給充足的實體惡性腫瘤，由于癌細胞的過度增殖、無序性分化以及腫瘤微血管構建的延后性，導致腫瘤組織內(nèi)部處于缺氧狀態(tài)，因此，癌細胞通過激活缺氧誘導因子(HIF)、促紅細胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等物質(zhì)的生成，促使癌細胞抵抗缺氧的微環(huán)境，從而維持癌細胞正常的增殖分化，轉移侵襲等生物學進程[5-7]。而HIF則是缺氧癌細胞中特異性活化的關鍵分子，目前已報道HIF-1α與腫瘤的生長增殖，微血管形成以及轉移侵襲密切相關[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，口腔鱗癌細胞內(nèi)的HIF-1α被激活，正常對照組及陰性對照組的細胞增殖沒有明顯差異，而HIF-1α基因被沉默后，細胞的增殖活性受到明顯抑制，增殖抑制率顯著高于其他兩處理組；HIF-1α基因表達在缺氧應激條件下維持了癌細胞的增殖活性。

圖 6 沉默HIF-1α基因對TSCCA細胞周期的影響

圖 7 沉默HIF-1α基因對TSCCA細胞周期相關蛋白表達的影響

另一方面，機體為了清除產(chǎn)生的癌細胞則需要通過多種途徑誘導癌細胞發(fā)生凋亡，進而控制腫瘤的進展，細胞凋亡在機體內(nèi)受到一系列相關途徑的調(diào)控，其中以受體和線粒體各自驅動的凋亡通路為核心[9]。線粒體途徑的激活與否與外膜的通透性密切相關，當其受到某種程度的影響是，促凋亡基因將從膜間隙轉運到胞質(zhì)中，進而啟動Caspase級聯(lián)反應，導致細胞出現(xiàn)相應的凋亡現(xiàn)象，而線粒體外膜的通透程度是由Bcl-2家族內(nèi)部諸多蛋白彼此調(diào)控決定的[10]。本研究發(fā)現(xiàn)：HIF-1α基因沉默后，導致線粒體膜上的抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降，促凋亡蛋白Bax表達量上升，從而使二者間的絡合作用喪失，無法形成具有選擇性的二聚體，線粒體膜內(nèi)的Cytochrome C外滲進入細胞質(zhì)，促進了Caspase-3的剪切，進一步破壞了PARP的蛋白活性，引發(fā)了Caspase級聯(lián)反應，導致細胞內(nèi)眾多功能蛋白發(fā)生失活，進一步破壞了細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，加速了死亡的裂解死亡；因此，HIF-1α的表達與內(nèi)源性線粒體依賴性凋亡存在密切聯(lián)系，HIF-1α的激活，進一步抑制了口腔鱗癌細胞的凋亡，使得癌細胞對缺氧微環(huán)境產(chǎn)生抗性，從而維持自身的穩(wěn)態(tài)。

癌癥的不斷增殖與癌細胞異常的周期進程密切相關，細胞周期的精密控制對生物體的分化、發(fā)育、遺傳及生存活動均具有很大的影響力，可通過不同時相的相互轉變使細胞進入增殖、分化或死亡等狀態(tài)[11]。本實驗結果表明，正常對照組及陰性對照組對人口腔鱗癌細胞不具有明顯的周期阻滯作用，而HIF-1α基因沉默后，細胞周期被阻滯在G2/M期。并且，細胞周期素(Cyclin)，細胞周期素依賴性激酶(Cyclin dependent kinases，CDKs)以及CDK抑制因子(CDK inhibitor，CKI)三者共同調(diào)控著細胞周期進程[12]。其中G2/M期相關的蛋白有Cyclin A/B和CDK1/2。CDK1與Cyclin B，CDK2與Cyclin A可以形成復合物，2 種復合物的產(chǎn)生可以使細胞越過G2期檢驗點，從而使細胞進入增殖分裂期。Western Blot實驗結果表明，HIF-1α基因沉默后，Cyclin A/B和CDK1/2表達量下降，并且能夠與CDK1/Cyclin B，CDK2/Cyclin A兩種復合物結合的CDK抑制因子p21蛋白表達量升高。因此，HIF-1α基因沉默后，引起細胞周期阻滯的作用機制可能是，HIF-1α的基因沉默，導致p21蛋白的抑制作用被解除，使細胞在進入周期檢驗點時，p21與Cyclin B1/ CDK1復合體結合，導致細胞復合體無法發(fā)生磷酸化激活，使細胞周期阻滯在G2/M期，細胞無法進行有絲分裂，從而達到抑制口腔鱗癌細胞增殖的作用。

綜上所述，缺氧條件下，沉默HIF-1α基因能夠抑制口腔鱗癌細胞的增殖，促使癌細胞發(fā)生線粒體依賴性凋亡，并使癌細胞發(fā)生G2/M期周期阻滯。HIF-1α與口腔鱗癌細胞的增殖、凋亡及周期存在密切相關性，阻斷HIF-1α的表達對于治療口腔鱗癌可能具有重要的意義。