(山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所/特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)試驗(yàn)室, 山西 長(zhǎng)治 046011)

谷子(Setariaitalica(L.)Beauv.)是重要的區(qū)域性特色雜糧作物，抗旱耐瘠薄，水分利用率高，是應(yīng)對(duì)未來(lái)水資源短缺的戰(zhàn)略儲(chǔ)備作物。谷子營(yíng)養(yǎng)豐富，含有包括維生素B 1、葉酸、鈣、鐵、鋅、硒等45種人體必需的營(yíng)養(yǎng)成分，被譽(yù)為“天然全價(jià)植物營(yíng)養(yǎng)師”。谷子是二倍體作物，基因組較小，適宜作為C4植物功能基因組研究的模式作物。谷子與水稻、小麥等主要作物相比，生產(chǎn)投入小，基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱，目前尚無(wú)可供利用的突變體庫(kù)，而構(gòu)建突變體庫(kù)是研究谷子功能基因最直接最有效的方法。

構(gòu)建作物豐富多樣的突變體庫(kù)是研究其功能基因組學(xué)的重要基礎(chǔ)。甲基磺酸乙酯(EMS，ethyl methane sulfonate)作為誘變劑獲得突變體，具有誘變效率高、操作簡(jiǎn)便、后代遺傳穩(wěn)定等多重優(yōu)點(diǎn)，是理想的誘變方法[1]。EMS突變體庫(kù)的構(gòu)建在玉米、水稻、小麥、大白菜、蕓豆、苜蓿等多種作物[2-4]中均有報(bào)道。有關(guān)谷子EMS誘變的研究較少，Gupta等[5]1975年利用γ射線加0.1% EMS、0.1% DES誘變谷子葉綠素突變體，研究發(fā)現(xiàn)，0.1% EMS誘變谷子24 h，M1植株突變率為15.3%，M2植株突變率為4.58%；24 h處理的谷子M1植株突變率明顯高于6 h、12 h和18 h處理。李偉等[6]采用裂區(qū)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同濃度和時(shí)間梯度處理豫谷1號(hào)種子，發(fā)現(xiàn)豫谷1號(hào)的適宜誘變條件為清水浸種過(guò)夜，1.0% EMS處理8 h。王軍等[7]分別用0.8%和1.0%的EMS誘變長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)，明確了1.0% EMS處理長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)可產(chǎn)生更多的突變單株。

晉谷21號(hào)因品質(zhì)優(yōu)良、適口性好，外觀品質(zhì)佳，已成為山西省的主栽品種，但晉谷21號(hào)受白發(fā)病困擾已久，本試驗(yàn)選用晉谷21號(hào)種子作為EMS誘變的試驗(yàn)材料，探討不同處理濃度及時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)、胚根伸長(zhǎng)及成苗的影響，旨在揭示EMS不同處理濃度對(duì)晉谷21號(hào)種子萌發(fā)的影響，篩選出最適的誘變條件，同時(shí)探究EMS對(duì)種子植株產(chǎn)生的影響，為后期谷子EMS抗病突變體庫(kù)的建立及優(yōu)良品種的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為山西省優(yōu)良谷子品種晉谷21號(hào)成熟種子，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所提供；EMS(M 0880-5 G)購(gòu)自上海生工，由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，以1×磷酸緩沖液(0.01 mol·L-1PBS溶液，pH=7.2)的稀釋配制。以5%硫代硫酸鈉(Na2S2O3)作為終止和解毒劑，化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)在2018年0.2%～1.6% EMS濃度篩選的基礎(chǔ)上，參照李偉等[6]的方法采用裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主處理(A)為EMS濃度處理，設(shè)5個(gè)水平，依次是A1～A5(0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%)EMS濃度處理。副處理(B)為種子不浸種或清水浸種過(guò)夜，根據(jù)誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)8個(gè)水平，依次為B1：浸種，誘導(dǎo)8 h處理；B2：不浸種，誘導(dǎo)8 h處理；B3：浸種，誘導(dǎo)9 h處理；B4：不浸種，誘導(dǎo)9 h處理；B5：浸種，誘導(dǎo)10 h處理；B6：不浸種，誘導(dǎo)10 h處理；B7：浸種，誘導(dǎo)11 h處理；B8：不浸種，誘導(dǎo)11 h處理，共計(jì)40個(gè)組合。以1×PBS溶液浸種處理作對(duì)照。處理時(shí)將三角瓶置于40 r·min-1的搖床上，保證種子與處理液充分接觸。處理結(jié)束后，加5% Na2S2O3洗滌3次，再用蒸餾水清洗3次，將清洗后的種子放在濾紙上吸干水分，每種處理挑選100粒飽滿的種子均勻置于鋪有2層濕潤(rùn)生根濾紙的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于組培室中30 ℃培養(yǎng)，每天10 h正常光照，及時(shí)補(bǔ)充水分。3 d后調(diào)查發(fā)芽勢(shì)，7 d后調(diào)查發(fā)芽率，分別在每個(gè)處理組中隨機(jī)抽取10株幼苗，測(cè)定其莖長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)。

發(fā)芽勢(shì)(%)=(第3天發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(第7天發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總粒數(shù))×100%；

平均莖長(zhǎng)(cm)=∑第7天發(fā)芽種子的長(zhǎng)度(莖基部到葉尖的長(zhǎng)度)/N;(N表示計(jì)算發(fā)芽長(zhǎng)度的種子個(gè)數(shù))。

平均胚根長(zhǎng)(cm)=∑第7天發(fā)芽種子的長(zhǎng)度(種子基部到根尖的長(zhǎng)度)/N;(N表示計(jì)算發(fā)芽長(zhǎng)度的種子個(gè)數(shù))[8]。

1.3 EMS處理對(duì)田間幼苗的影響

確定半致死劑量后，采取相應(yīng)條件的處理種子，在試驗(yàn)田的小區(qū)內(nèi)開溝播種，行距30 cm。出苗后免間苗，及時(shí)蹲苗保證幼苗茁壯生長(zhǎng)，田間管理采用常規(guī)方式進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將觀測(cè)記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多因素試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性測(cè)驗(yàn)采用DPS分析軟件進(jìn)行，多重比較采用Ducan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對(duì)晉谷21號(hào)種子萌發(fā)的影響

2.1.1浸種對(duì)晉谷21號(hào)種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的影響

相同濃度EMS處理下，提前浸種的種子較未浸種種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率高。如圖1和表1所示，對(duì)照組在浸種與未浸種條件下，種子平均發(fā)芽勢(shì)分別為94.54%和92.37%，平均發(fā)芽率分別為98.54%和96.25%，無(wú)顯著差異，表明浸泡與否對(duì)谷種的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率無(wú)顯著影響；而在其他濃度EMS處理下，提前浸種發(fā)芽勢(shì)較未浸種高1.46%～11.67%，發(fā)芽率較未浸種高1.31%～12.59%。0.8%的EMS處理9 h，浸種與未浸種種子發(fā)芽勢(shì)分別為65.67%和58.67%，相差7.0%，發(fā)芽率相差11.11%；1.0%的EMS處理9 h，浸種與未浸種種子發(fā)芽勢(shì)分別為48.25%和39.25%，相差9.0%，發(fā)芽率分別為59.02%和47.78%，相差11.54%，差異顯著；而當(dāng)EMS提高至1.2%時(shí)，浸種與未浸種種子間的發(fā)芽率差異較小?？赡苁请S著處理時(shí)間延長(zhǎng)，較未浸種種子相比，提前浸種的種子達(dá)到吸脹狀態(tài)，吸收EMS溶液量減少。由此可知，晉谷21號(hào)種子的發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率均隨著EMS濃度的升高而降低，同一處理水平下，提前浸種比未浸種種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率高，EMS濃度越低差異越顯著。

2.1.2EMS處理對(duì)晉谷21種子發(fā)芽率的影響

如圖1所示，與對(duì)照相比，隨著EMS濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，晉谷21號(hào)的發(fā)芽率呈逐漸降低的趨勢(shì)，與馬海新等[9]研究結(jié)果一致。其中EMS濃度為0.8%，處理時(shí)間11 h，晉谷21號(hào)的發(fā)芽率由對(duì)照組的98.54%降到46.44%，而當(dāng)濃度增大到1.1%、1.2%時(shí)，晉谷21號(hào)的發(fā)芽率分別降至28.58%和16.02%，說(shuō)明晉谷21號(hào)對(duì)EMS較敏感，且EMS濃度越高，對(duì)種子的生理?yè)p傷越大，其發(fā)芽率越低。1.0% EMS濃度處理10 h，種子發(fā)芽率為49.03%，最接近半致死率(植株存活率50%)。結(jié)合表1，綜合考慮相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率，確定EMS的最佳誘變組合為提前浸種的種子利用1.0% EMS處理10 h。

2.1.3EMS處理對(duì)晉谷21號(hào)種子莖長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)的影響

EMS處理晉谷21號(hào)種子7 d后，每個(gè)處理分別隨機(jī)抽取10株幼苗，測(cè)定其莖長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)，由圖2可以看出，隨著EMS濃度的增大和處理時(shí)間延長(zhǎng)，晉谷21號(hào)的莖長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)較對(duì)照組變短，呈下降趨勢(shì)。在EMS濃度為0.8%、0.9%時(shí)，4個(gè)時(shí)間組處理下晉谷21號(hào)的莖長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)的差異不顯著；在EMS濃度為1.1%、1.2%時(shí)，4個(gè)時(shí)間組處理下莖長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)的差異逐漸變大，其中以1.2% EMS處理11 h最明顯。ck的莖長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)分別為4.19 cm、7.91 cm，而EMS濃度1.2%處理11 h時(shí)的莖長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)分別為1.19 cm、1.84 cm，僅為ck的28.40%和23.26%。表明EMS能夠抑制晉谷21號(hào)種子的莖、胚根的生長(zhǎng)。EMS濃度越高，晉谷21號(hào)種子萌發(fā)受抑制效應(yīng)越大，莖長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)越短，所需發(fā)芽時(shí)間越長(zhǎng)。

2.2 田間觀察與分析

使用EMS濃度為1.0%、處理時(shí)間10 h的最適誘變條件處理5 000粒種子，開溝播種于試驗(yàn)田的小區(qū)內(nèi)，其中能夠萌發(fā)的種子有2 439粒，最終能夠成苗的M1代誘變株為1 468株。由于一些隱性變異要到M2代才會(huì)發(fā)生性狀分離，因此M1代出現(xiàn)的變異類型不多，總體上有黃化苗、白化苗、葉色變異、分蘗、莖稈紅色、穗型突變體等變異。對(duì)黃化苗和白化苗進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，EMS處理的種子幼苗更容易出現(xiàn)黃化苗，黃化苗的突變率(1.25%)大于白化苗的突變率(1.13%)；統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。幼苗期黃化苗表現(xiàn)為2種類型：第1種整個(gè)幼苗都發(fā)生黃化；第2種只有部分葉片發(fā)生黃化，有的幼苗同一葉片上只有一半發(fā)生黃化；白化苗表現(xiàn)為整個(gè)幼苗都發(fā)生白化。有的黃化苗慢慢死去，有的黃化苗逐漸轉(zhuǎn)綠，但由于葉綠素含量較低，植株的長(zhǎng)勢(shì)較對(duì)照差。而白化苗由于光合作用能力差很快死亡。

表1 EMS處理對(duì)晉谷21號(hào)種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響

圖1 不同處理對(duì)晉谷21號(hào)種子發(fā)芽率的影響

圖2 不同濃度EMS處理對(duì)晉谷21號(hào)種子莖長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)的影響

表2 EMS誘變晉谷21號(hào)M1群體突變表型分類

3 討 論

近年來(lái)，EMS廣泛用于禾本科不同作物如水稻、玉米、小麥、大麥、高粱、苦蕎等誘變育種[10-12]，利用EMS誘變構(gòu)建的突變?nèi)后w在基因功能研究上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。研究表明，適宜的誘變濃度和誘變時(shí)間是EMS誘變育種提高變異率、獲得理想突變體的關(guān)鍵[13]。只有在適宜的濃度范圍內(nèi)，作物才能保持其優(yōu)良性狀并產(chǎn)生更多新的變異，一般以誘變后植株存活50%所需的EMS濃度即半致死劑量(LD50)作為誘變敏感性指標(biāo)[14]。不同作物所需的EMS誘變濃度和誘變時(shí)間不同。許云峰等[15]利用0.3%的EMS處理小麥品種“煙農(nóng)15”4 h，獲得11個(gè)農(nóng)藝性狀發(fā)生明顯變異的突變系；張維宏等[16]采用1.0%的EMS處理小麥“TcLr 19”8 h，獲得較穩(wěn)定的小麥感葉銹病突變體；董文科等[17]對(duì)黑麥草品種“首相”種子進(jìn)行誘變處理，結(jié)果表明，0.8%EMS處理24 h可作為適宜誘變組合；甜蕎EMS誘變的最適濃度為1.0%，處理時(shí)間為4 h[28]。即使相同作物的不同品種EMS誘變濃度和誘變時(shí)間也不盡相同。冀谷31的最佳誘變條件為1.0% EMS處理6 h，而冀谷25的最佳誘變條件為0.8% EMS處理10 h[18]；谷子十里香的適宜誘變條件是1.2% EMS處理16 h[19]。本研究結(jié)合各處理的種子發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)，最終確定晉谷21號(hào)最佳誘變濃度為種子提前浸種，1.0% EMS處理10 h。

EMS誘變能夠抑制種子的萌發(fā)，抑制幼苗莖尖、胚根的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，EMS濃度越高越易溶解產(chǎn)生有機(jī)酸，毒害作用越強(qiáng)，會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生不可逆的嚴(yán)重?fù)p傷[20]。臧輝等[21]利用EMS處理羊草種子發(fā)現(xiàn)，EMS濃度越高，對(duì)種子萌發(fā)和幼苗的抑制作用越強(qiáng)，表現(xiàn)為萌發(fā)時(shí)間延遲、發(fā)芽率降低、苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)變短；邱婷婷等[22]利用不同濃度EMS處理華南5號(hào)木薯種子，發(fā)現(xiàn)EMS濃度越高，對(duì)種子的生理?yè)p傷越大，并導(dǎo)致其發(fā)芽率越低。齊曉花等[23]利用EMS誘變構(gòu)建黃瓜突變體庫(kù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，種子出苗率隨著EMS濃度的提高而下降，2.5% EMS處理的種子出苗率只有19%，比對(duì)照降低了76%。本研究中0.8% EMS處理種子11 h，發(fā)芽率比對(duì)照組低52.1%，當(dāng)濃度增加到1.2%時(shí)，晉谷21號(hào)的發(fā)芽率比對(duì)照組低82.52%，莖長(zhǎng)和胚根僅為對(duì)照的28.40%和23.26%。說(shuō)明EMS誘變抑制了晉谷21號(hào)種子萌發(fā)時(shí)莖尖、胚根的生長(zhǎng)，對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用隨著濃度提高而增強(qiáng)，這可能是高濃度的EMS和長(zhǎng)時(shí)間的處理對(duì)種子產(chǎn)生了不可逆的毒害作用。

EMS誘發(fā)的突變一般為顯性突變，誘變性狀一般為主基因控制的性狀，易于突變體的篩選[24]。EMS誘變芝麻的M1代植株出現(xiàn)了葉片黃化、花序突變、花冠突變等現(xiàn)象，誘變率為7.60%[25]；在裸燕麥種子誘變中產(chǎn)生了莖稈顏色變異、株高變異、葉型變異、葉色變異類型[26]，EMS誘變番茄出現(xiàn)花柱性狀、果實(shí)形態(tài)和株型變異[27]。本研究中也發(fā)現(xiàn)M1代谷子出現(xiàn)黃化苗、白化苗、莖稈紅色等變異，說(shuō)明EMS誘變對(duì)種子產(chǎn)生影響，引起其植株的表型變化，甚至可能會(huì)引起植株遺傳水平的變異。因此在后續(xù)研究中，可利用EMS持續(xù)誘變?nèi)槭炱?、蠟熟期的穗，獲得有效的突變體。在本實(shí)驗(yàn)中篩選的突變體表型變異性狀與遺傳水平變化的聯(lián)系需要進(jìn)一步研究。在后期構(gòu)建谷子突變體庫(kù)過(guò)程中，依據(jù)EMS誘變一般為顯性突變的特點(diǎn)，將M1候選突變體上收獲的所有種子用于M2性狀測(cè)定，變異鑒定，并判定這些變異能否遺傳。性狀優(yōu)良的突變體材料可進(jìn)一步進(jìn)行特異性、一致性、穩(wěn)定性測(cè)試(DUS測(cè)試)，為晉谷21號(hào)抗病突變體庫(kù)的建立奠定基礎(chǔ)。