吳帆 王衛(wèi)國 班晶浩 楊國利

臨床研究表明樹脂材料的遠期的成功率較低，使用壽命較短[1]。造成樹脂遠期失敗的最主要原因是樹脂產(chǎn)生了繼發(fā)齲。樹脂充填物在口內(nèi)使用過程中，變形鏈球菌等產(chǎn)酸和耐酸細菌積聚在牙齒和樹脂填充物上，并滲入樹脂與牙齒之間的微間隙，通過產(chǎn)酸造成牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)脫礦[2]。牙本質(zhì)脫礦后，唾液蛋白酶或內(nèi)源性肽酶如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和半胱氨酸組織蛋白酶會導(dǎo)致牙本質(zhì)膠原基質(zhì)的降解，從而在牙齒與樹脂之間產(chǎn)生繼發(fā)齲壞[3]。所以，產(chǎn)酸和耐酸細菌是造成樹脂繼發(fā)齲非常重要的一個因素，而研究出具有抗菌性能的樹脂一直是研究的熱點[4]。

含甲基丙烯酸酯基團的季銨鹽(QAS)單體作為一種可聚合的抗菌材料，可以與樹脂單體發(fā)生共價結(jié)合連接到樹脂基質(zhì)中[5]。QAS單體改性樹脂抗菌作用的發(fā)揮不依賴抗菌材料的析出，而是通過樹脂表面的正電荷及長鏈烷基發(fā)揮接觸抗菌作用[6]，所以改性材料具有穩(wěn)定、持久的抗菌性，且理化性能不會因為抗菌材料析出而下降[7-8]。但是，基于抗菌單體改性的樹脂材料在臨床中成功的應(yīng)用不僅依賴于其良好的抗菌性能及理化性能，還在很大程度上取決于其生物安全性能。目前大多數(shù)的QAS單體中僅含有一個或兩個甲基丙烯酸酯(MA)基團，與樹脂基質(zhì)的反應(yīng)活性和交聯(lián)度均較低，導(dǎo)致改性樹脂固化后殘留單體增多，改性樹脂的細胞毒性較凈樹脂高[9]。提高季銨鹽單體中MA基團的數(shù)目可以提高改性樹脂的交聯(lián)度[10-11]，有望降低樹脂中單體的殘留，從而提高其生物安全性。四甲基丙烯酸酯QAS單體具有4 個MA基團，有望改善改性樹脂的生物安全性。本研究對其細胞毒性及其引起細胞毒性的機理進行了初步研究，為改善含抗菌單體的齒科功能性樹脂材料的生物安全性、拓展其在深齲及牙髓保護方面的應(yīng)用提供理論及實驗支持。

1 材料及方法

1.1 材料

樹脂單體雙酚A甲基丙烯酸縮水甘油酯(Bis-GMA)、引發(fā)劑對二甲氨基苯甲酸乙酯(EDMAB)、樹脂稀釋單體雙甲基丙烯酸二縮三乙二醇酯(TEGDMA)、催化劑樟腦醌(CQ)(Sigma-Aldrich公司，美國)；四甲基丙烯酸酯季銨鹽單體(TMHDB，西安賽爾美生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備實驗樹脂 將Bis-GMA與TEGDMA按1∶1比例混合，置于磁力攪拌機上常溫避光攪拌4 h；按照表 1中的比例加入CQ和EDMAB，繼續(xù)常溫避光攪拌2 h制成凈樹脂。按照表 1中的比例向凈樹脂加入TMHDB(TH組)常溫避光攪拌4 h，未添加QAS單體的凈樹脂組為對照組(CO組)。

表 1 實驗分組及樹脂組成

1.2.2 樹脂浸提液制備 將樹脂滴入聚四氟乙烯模具(4 mm×10 mm×2 mm)中，兩面壓實載玻片，使用牙科光固化機(桂林市啄木鳥)每面光固化20 s，制成長條狀樹脂片。使用紫外線照射樹脂片雙面各30 min后，放入無菌離心管中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司, 美國)中于37 ℃浸提24 h，浸提標準為：樹脂表面積/浸提液體積為1.25 cm2/ml(ISO 10993-12標準)。浸提完成后使用0.22 μm的過濾器除菌。未用樹脂浸提的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基為陰性對照組(CK組)。浸提液制備完成后，按照對半稀釋的方法制備出5 個梯度濃度含樹脂浸提液的培養(yǎng)基。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 將凍存小鼠結(jié)締組織成纖維細胞 L929，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)蘇，培養(yǎng)，經(jīng)過3 次傳代，生長情況穩(wěn)定。

1.2.4 CCK-8實驗及細胞形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的受試細胞系，胰蛋白酶消化后制成2.5×104個/ml的單細胞懸液。將細胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板，每組6 個復(fù)孔，每孔200 μl(即5 000 個細胞/孔)，在 37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h使細胞貼壁，棄原培養(yǎng)液。TH組加入樹脂浸提原液及其稀釋液；CO組加入凈樹脂浸提原液及其稀釋液；CK組為不含浸提液的細胞培養(yǎng)液。孵育1、3、5 d后，使用LAS V4.9相差三目顯微鏡(Lecia公司，德國)觀察各組圖像，并進行照相；向每個孔中加入20 μl Cell Counting Kit-8(CCK-8，APE BIO公司，美國)染料溶液，再孵育4 h[9]。使用酶標儀測量每個孔中溶液在450 nm處的吸光度。使用以下公式計算細胞的相對生長速率(RGR)。

1.2.5 細胞周期分析 將細胞以1×105個/ml的濃度接種于6 孔板中，孵育24 h使細胞貼壁并達到80%融合。TH組加入樹脂浸提原液；CO組加入凈樹脂浸提原液；CK組為細胞培養(yǎng)液。孵育24 h后，收獲漂浮細胞和附著細胞，用PBS洗滌2 次，并重懸浮。 用10 ml冷的75%乙醇在4 ℃下固定過夜后，用PBS洗滌細胞，隨后在室溫下用200 μl碘化丙啶(PI)(Sigma-Aldrich公司，美國)溶液染色30 min。 使用流式細胞術(shù)(Becton-Dickinson公司，美國)測定細胞周期分布，每個樣本檢測5 000 個細胞。

1.2.6 細胞凋亡及壞死的分析 將細胞以1×105個/ml的濃度接種于6 孔板中，孵育24 h使細胞貼壁并達到80%融合。TH組加入樹脂浸提原液；CO組加入凈樹脂浸提原液；CK組為細胞培養(yǎng)液。孵育24 h后，收獲漂浮細胞和附著細胞，用PBS洗滌2 次，并重懸浮。隨后根據(jù)標準方法，在4 ℃用V-Alexa Fluor 488(Invitrogen公司，美國)和PI染色10 min。流式細胞儀分析存活、早期凋亡、晚期凋亡/壞死、及壞死細胞所占比例，每個樣本檢測5 000 個細胞。

1.2.7 細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平分析 將細胞以1×105個/ml的濃度接種于6 孔板中，孵育24 h使細胞貼壁并達到80%融合。TH組分別加入樹脂浸提原液；CO組加入凈樹脂浸提原液；CK組為細胞培養(yǎng)液。孵育3 h后，收獲漂浮細胞和附著細胞，用PBS洗滌2 次，并重懸浮。將細胞用10 μmol/L DCFH-DA(上海翊圣生物)在37 ℃下染色20 min。 隨后，分離細胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基洗滌，并立即進行流式細胞術(shù)分析ROS水平，每個樣本檢測5 000 個細胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對所有數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計學(xué)分析，行單因素方差分析，樣本間的兩兩比較用Tukey 檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 1 L929細胞在不同濃度的樹脂浸提液中培養(yǎng)1、3、5 d的形態(tài)及數(shù)目

2 結(jié) 果

2.1 細胞增殖分析

L929細胞在不同濃度的樹脂浸提液中培養(yǎng)1、3、5 d的細胞數(shù)目見圖 1。隨著培養(yǎng)時間的延長，含有不同浸提液濃度的CO組和TH組的細胞數(shù)目均出現(xiàn)明顯上升。培養(yǎng)第一天時，隨著浸提液濃度的上升，細胞的數(shù)目在不斷的減少；但在培養(yǎng)第三和第五天時，隨著浸提液濃度的上升，細胞數(shù)目組間差異不明顯。

L929細胞在樹脂浸提原液中培養(yǎng)1、3、5 d后細胞的RGR見圖 2。培養(yǎng)第一天時L929細胞在CO和TH浸提液中的RGR均較陰性對照組低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；在培養(yǎng)第三天TH組的RGR較CK組和CO組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；在培養(yǎng)第五天時CO組和TH組的RGR又較CK組低，其中CO組與CK組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 細胞周期分析

CO組與TH組的G1期所占的細胞比例較CK組下降，而S期所占細胞比例較CK組增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；CO組與TH組的G1和S期所占細胞比例無統(tǒng)計學(xué)差異；3 組的G2期細胞所占比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖 3)。

2.3 細胞凋亡及壞死分析

L929細胞在不同培養(yǎng)基中的細胞凋亡及壞死分析結(jié)果見圖 4。3 組活細胞、早期凋亡細胞以及晚期凋亡/壞死細胞所占比例之間無統(tǒng)計學(xué)差異。CO組在壞死細胞比例中高于CK組和TH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 ROS水平分析

L929細胞在不同培養(yǎng)基中的細胞凋亡及壞死分析結(jié)果見圖 5。CK組幾乎無ROS陽性細胞，而CO組與TH組ROS陽性細胞所占比例較CK組顯著上升。CO組與TH組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖 2 L929細胞在不同培養(yǎng)液中的相對增殖速率

圖 3 L929細胞在不同培養(yǎng)液中細胞周期分析(綠色： G1期； 黃色： S期； 藍色： G2期)

圖 4 L929細胞在不同培養(yǎng)液中凋亡及壞死分析

圖 5 L929細胞在不同培養(yǎng)液中ROS水平分析

3 討 論

基于季銨鹽的抗菌材料已經(jīng)運用于牙科樹脂材料[12]、骨水泥[13]、縫合線和敷料[14]等多種生物醫(yī)學(xué)材料的抗菌改性，并取得了令人滿意的抗菌性能。季銨鹽化合物的抗菌性能基于陽離子固定機理[15]，主要依賴于帶正電荷季銨基團吸引帶負電荷的細菌，與細菌接觸后季銨鹽單體中的長鏈烷基可以穿透細胞壁并與細胞膜中磷脂雙分子層發(fā)生反應(yīng)，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞質(zhì)外露，引起細菌死亡[16]。而真核細胞的細胞膜成分與細菌相似，也主要由磷脂雙分子層組成，季銨鹽從理論上來說也會對真核細胞包括人的細胞造成傷害[17]。此外，季銨鹽單體中的可聚合甲基丙烯酸酯基團也可能是它細胞毒性的另一個來源?？删酆霞谆┧狨セ鶊F是牙科單體的特征性基團，研究表明，常規(guī)的牙科甲基丙烯酸酯單體也具有一定的細胞毒性[18]。所以，研究并評估季銨鹽單體改性功能材料的生物安全性至關(guān)重要。

在生物的代謝過程中，會產(chǎn)生超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等一系列的活性氧[19]。細胞內(nèi)的氧化還原處于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，然而ROS大量產(chǎn)生時，超過細胞防御系統(tǒng)保護功能時，細胞內(nèi)氧化還原平衡被打破，進而會對細胞產(chǎn)生不良的影響。研究表明齒科單體以及季銨鹽單體引起細胞毒性的同時，伴隨著細胞內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生以及氧化還原平衡的破壞[20]。本研究的結(jié)果表明CK組中ROS含量非常少，而CO組和TH組中ROS含量均顯著上升，提示TMHDB與常規(guī)樹脂單體類似，引起細胞毒性與氧化還原平衡的破壞有一定的關(guān)系。另一方面CO組與TH組ROS水平之間無統(tǒng)計學(xué)差異，說明了兩種樹脂浸提液對細胞ROS水平作用相似，TMHDB的添加并沒有繼續(xù)增加細胞內(nèi)的ROS水平。

細胞內(nèi)過量的ROS可以攻擊細胞內(nèi)生物大分子包括DNA、蛋白質(zhì)及脂類等，引起DNA損傷，蛋白質(zhì)合成受阻，當損傷程度較輕時，細胞可以通過調(diào)節(jié)細胞周期，使細胞獲得足夠的時間對DNA損傷進行修復(fù)、合成足夠的蛋白質(zhì)；當損傷程度較重時，細胞會通過凋亡或壞死發(fā)生死亡[21]。本實驗通過對細胞死亡情況分析，可見CO組、TH組與CK組3 組活細胞、早期凋亡細胞以及晚期凋亡/壞死細胞所占比例之間均無統(tǒng)計學(xué)差異，僅CO組的壞死細胞比例高于其他兩組。這說明凈樹脂浸提液以及含TMHDB的樹脂浸提液對細胞的損傷程度都不重，并沒有觸發(fā)細胞凋亡信號引起細胞凋亡。細胞周期的結(jié)果顯示CO組和TH組的S期所占細胞比例較CK組顯著上升，G1期所占的細胞比例較CK組顯著下降，這說明細胞在S期發(fā)生了阻滯。S期進行細胞DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成階段，并完成染色體的復(fù)制。S期阻滯說明CO組以及TH組中DNA復(fù)制及蛋白質(zhì)合成速率的下降，細胞需要更多的時間來合成DNA和蛋白質(zhì)。CO組與TH組的G1和S期所占細胞比例無統(tǒng)計學(xué)差異；說明CO組和TH組兩者對細胞周期的影響相似，向樹脂中添加TMHDB并沒有對細胞周期造成額外的不良影響。

細胞增殖分析是宏觀層面上細胞活性的分析，可以直觀的反應(yīng)細胞的數(shù)量及增殖活性。本研究中所取的第一天、第三天和第五天這3 個觀察點主要是對應(yīng)于細胞生長曲線中的潛伏期、指數(shù)生長期和穩(wěn)定期。細胞在經(jīng)過一天左右的潛伏期后，即進入大量分裂的指數(shù)生長期，而5 d左右時細胞數(shù)量趨近于飽和到達穩(wěn)定期。本研究中顯微鏡鏡檢及CCK-8結(jié)果表明均表明CO與TH組在第一天的細胞數(shù)量及RGR均明顯小于空白對照組，且隨著浸提液濃度上升，細胞數(shù)量及RGR在不斷的減小。在培養(yǎng)第三天TH組的RGR較CK組和CO組高，其原因可能是TH組細胞較其他兩組更早的進入了指數(shù)生長期，在第三天這個觀察點時TH組細胞已經(jīng)比其他兩組進行了更多次數(shù)的分裂，造成在第三天時TH組細胞數(shù)量是最多的；而在培養(yǎng)第五天時CO組和TH組的RGR又較CK組低，其中CO組與CK組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義則說明在穩(wěn)定期時CO和TH組的細胞數(shù)量仍較CK組少，而CO組顯著小于CK組，這主要還是因為樹脂浸提液對穩(wěn)定期的細胞總數(shù)量造成了一定的影響，但樹脂浸提液對細胞增殖的影響是短期且非致命的，培養(yǎng)時間延長后細胞通過自身調(diào)節(jié)可以消除浸提液對細胞增殖帶來的部分不利影響。

綜上所述，本研究可以得到以下結(jié)論：樹脂浸提液的確會造成一定的細胞毒性，但這種細胞毒性是短期、可控的，可以通過細胞的自身調(diào)節(jié)來消除，并沒有造成細胞凋亡等嚴重的后果；CO組與TH組在ROS水平,細胞周期，細胞凋亡以及細胞增殖速率中均無明顯差異，TMHDB單體的添加并沒有增加樹脂的細胞毒性。