孫俊澤 馬洪 胡赟 鮑玲娜

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的頜面部惡性腫瘤，有高度的惡性、強(qiáng)侵襲、快轉(zhuǎn)移等特性[1]。每年約有11 000例死亡，病死率仍逐年上升，存活率低主要與腫瘤侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)聯(lián)密切。因此,早期診斷和靶向抑制其發(fā)生進(jìn)展及轉(zhuǎn)移是防止和治療的關(guān)鍵。S100A8/A9蛋白是以Ca2+依賴形式的一種鈣結(jié)合蛋白，研究表明，S100A8和S100A9在胃癌、結(jié)直腸癌及鼻咽癌等腫瘤性疾病侵襲轉(zhuǎn)移中建立預(yù)轉(zhuǎn)移性龕，加快腫瘤轉(zhuǎn)移[2]。有研究報(bào)道，抗S100A8/A9蛋白單克隆抗體可以有效抑制小鼠模型中S100A8/A9蛋白調(diào)控的黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[3]。但S100A8/A9蛋白在腫瘤侵襲遷移中的作用和機(jī)理尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探究S100A8/A9蛋白對(duì)OSCC細(xì)胞侵襲遷移和p38MAPK信號(hào)通路的影響及機(jī)制，為OSCC靶向藥物研發(fā)及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

舌鱗癌細(xì)胞SCC-25和CAL-27(ATCC,USA)；S100A8蛋白和S100A9蛋白(Abcam,USA)；胎牛血清(BI,IRS)；DMEM-F12培養(yǎng)基和高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco,USA)；兔抗p-p38MAPK、p38MAPK單克隆抗體、抗gapdh抗體及二抗(CST,USA)；通路抑制劑SB203580(MCE,USA)；顯影液(Millipore，USA)；CCK-8試劑盒(Biosharp)；Transwell小室、培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿(Corning,USA)；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease 2,MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease 2，MMP-9)序列設(shè)計(jì)(廣州博銳生物)；RNA提取試劑盒(Roche,德國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA,日本)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含有DMEM-F12/DMEM培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)SCC-25和CAL-27，培養(yǎng)的條件為37 ℃、5%CO2，細(xì)胞增殖匯合達(dá)80%時(shí)傳代。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 收集對(duì)數(shù)周期的細(xì)胞，先后沖洗、消化、調(diào)整細(xì)胞密度，在96孔板培養(yǎng)使每孔約含103個(gè)細(xì)胞，將S100A8和S100A9重組蛋白混合并在4 ℃下孵育1 h以形成S100A8/A9蛋白復(fù)合物[4]，細(xì)胞基本貼壁后，調(diào)整S100A8/A9蛋白濃度為0、1、5、15、25、35 μg/ml的無血清培養(yǎng)基，24 h的時(shí)候在每孔按說明書加適量的藥劑，等1.5 h后用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度數(shù)的值。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)周期的細(xì)胞密度大約為1×105個(gè)/ml，細(xì)胞貼壁，槍頭垂直孔板劃線，清洗劃下來的多余細(xì)胞,加入不含血清的培養(yǎng)基，設(shè)置S100A8/A9組及Control組，S100A8/A9組中加入1 μg/ml S100A8/A9蛋白，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，于0、24、48、72 h進(jìn)行拍照。

1.2.4 細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)收集對(duì)數(shù)周期的細(xì)胞，先后清洗、消化，調(diào)整細(xì)胞密度。在Transwell小室的下室中加600 μl的培養(yǎng)基且每毫升含有1 μg S100A8/A9蛋白,上室1×105個(gè)/200 μl細(xì)胞，24 h后小室取出清洗，先固定后染色，清洗干燥后鏡下隨機(jī)選5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)小室聚碳酸酯膜下表面細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)操作步驟按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)調(diào)整細(xì)胞密度，在小室上表面涂抹適量厚度基質(zhì)膠，然后再加入1×105個(gè)/200 μl細(xì)胞，后續(xù)操作步驟同上。最后顯微鏡下觀察小室聚碳酸酯膜下表面附著的侵襲細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取選5 個(gè)視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western blot 蛋白質(zhì)印跡法按照細(xì)胞的裂解方法提細(xì)胞總蛋白,每條泳道含有60 μg總蛋白,電泳完成后將10%SDS-PAGE膠上目的蛋白轉(zhuǎn)到膜上,室溫條件下封閉約2 h,一抗(1∶2 000)在4 ℃條件下過夜孵育,TBST洗3遍,在室溫條件下二抗(1∶8 000)孵育大約2 h;TBST洗3 遍,成像系統(tǒng)下進(jìn)行成像。圖形分析軟件Image J對(duì)圖片進(jìn)行處理,用每一個(gè)組的p-p38MAPK、p38MAPK和gapdh蛋白灰度的比分析樣品蛋白的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光染色 收集對(duì)數(shù)周期的細(xì)胞，先后清洗、消化，調(diào)整細(xì)胞密度。根據(jù)蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果設(shè)為0 h組、1 h組、12 h組，固定細(xì)胞，封閉，加入一抗p-p38MAPK(1∶50)4 ℃條件下過夜孵育, PBS沖洗3次，熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3 次，封片后熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.7 RT-qPCR 將細(xì)胞接種在24 孔板中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為3 個(gè)組,分別為:Control組(DMSO)、S100A8/A9組和抑制劑組(S100A8/A9+SB203580)。RNA的檢測(cè)方法參照說明書，引物序列:GAPDH:F:5'-GTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3',R:5'-ACCACCTTCTTGATGTCATCAT-3';MMP-2:F:5'-CTGATGTCCAGCGAGTGGAT-3',R:5'-CTTCACCTCATTGTATCTCCAGAA-3';MMP-9:F:5'-CAGTACCGAGAGAAAGCCTATT-3',R:5'-CAGGATGTCATAGGTCACGTAG-3';以Control組作為對(duì)照組，計(jì)算Ct數(shù)值后，根據(jù)2-ΔΔCt算出各個(gè)組的mRNA相對(duì)表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 S100A8/A9蛋白對(duì)OSCC細(xì)胞增殖活力的影響

不同濃度的S100A8/A9蛋白處理OSCC細(xì)胞24 h后,檢測(cè)S100A8/A9蛋白對(duì)細(xì)胞增殖活力的變化見圖 1，細(xì)胞增殖活力有濃度依賴性(P<0.05)。與Ang[5]等研究結(jié)果近似，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，用1 μg/ml S100A8/A9蛋白處理細(xì)胞。

圖 1 S100A8/A9蛋白對(duì)SCC-25及CAL-27細(xì)胞增殖的影響

2.2 S100A8/A9蛋白對(duì)OSCC細(xì)胞侵襲遷移的影響

2.2.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 結(jié)果如圖 2，與對(duì)照組相比，隨著時(shí)間變化細(xì)胞生長(zhǎng)向劃痕的地方遷移，S100A8/A9組的劃痕區(qū)域小于同一時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組(P<0.05)。

2.2.2 Transwell實(shí)驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A8/A9組(83±7.32,89±5.31)比對(duì)照組(59±5.91,57±4.88)細(xì)胞遷移數(shù)顯著要多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A8/A9組(80±3.91,81±3.31)比對(duì)照組(53±3.22,52±3.57)細(xì)胞侵襲數(shù)顯著要多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖 3)。

2.3 S100A8/A9蛋白對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞p38MAPK通路活化的影響

添加1 μg/ml S100A8/A9蛋白處理口腔鱗癌細(xì)胞后,磷酸化p38MAPK水平在0.5～6 h內(nèi)明顯升高(圖 4),12 h磷酸化水平降低，而總p38MAPK蛋白表達(dá)水平無明顯影響。在存在或不存在10 μmol/L SB203580的情況下,用S100A8/A9蛋白處理細(xì)胞0.5 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化p38MAPK水平在p38MAPK信號(hào)通路抑制后顯著下降。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果中的磷酸化p38MAPK水平(圖 5)與免疫印跡檢測(cè)的結(jié)果一致，S100A8/A9蛋白對(duì)p38MAPK通路存在激活作用。

圖 2 S100A8/A9蛋白對(duì)SCC-25和CAL-27細(xì)胞遷移能力的影響(Transwell實(shí)驗(yàn)，×100)

圖 4 S100A8/A9蛋白對(duì)SCC-25及CAL-27細(xì)胞p38MAPK通路的影響(Western blot)

圖 5 p-p38在OSCC細(xì)胞中的定位表達(dá)(熒光顯微鏡， ×400)

2.4 阻斷p38MAPK信號(hào)通路后S100A8/A9蛋白對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移的影響

遷移Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑組(42±5.06,38±2.99)比空白組(56±2.18,57±2.14)和S100A8/A9蛋白組(87+4.10,90+3.56)細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少了(P<0.001)。侵襲Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制劑組(40±3.25,37±2.92)比空白組(52±3.16,55±2.44)和S100A8/A9蛋白組(80±4.58,81±3.81)細(xì)胞侵襲數(shù)顯著減少了(P<0.001)(圖 6)。

2.5 MMP-2和MMP-9參與S100A8/A9蛋白誘導(dǎo)的口腔鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移

通過RT-qPCR檢測(cè)對(duì)照組、S100A8/A9蛋白組和SB203580組口腔鱗癌細(xì)胞中目的基因MMP-2及MMP-9和GAPDH的表達(dá)、MMP-2和MMP-9基因表達(dá)量的比值，SB203580組(0.29±0.23，0.14±0.04)的MMP-2 mRNA表達(dá)情況分別與對(duì)照組(0.89±0.50，0.49±0.21)和S100A8/A9組(2.77±0.62，1.40±0.45)相比呈低表達(dá)(P<0.001)。SB203580組(0.15±0.09，0.20±0.09)的MMP-9 mRNA表達(dá)情況分別與對(duì)照組(0.55±0.27，0.72±0.25)和S100A8/A9組(1.30±0.44，1.27±0.32)相比呈低表達(dá)(P<0.001)。

3 討 論

S100蛋白家族是一個(gè)由小分子量蛋白(10000～20000) 組成的鈣結(jié)合蛋白家族，特異性表達(dá)于脊椎動(dòng)物中，共有25名成員。S100A8/A9蛋白是S100蛋白家族重要的蛋白，位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶，該區(qū)域穩(wěn)定性差，可能與惡性腫瘤發(fā)生具有密切關(guān)系[6]。S100A8和S100A9常以同源二聚的結(jié)構(gòu)存在,通過結(jié)合成穩(wěn)定復(fù)合物而發(fā)揮作用，但由于二聚體通常不可檢測(cè)，這也給S100A8/A9蛋白的研究帶來了困難和挑戰(zhàn)[7]。S100A8和S100A9在腫瘤細(xì)胞中主要通過免疫的細(xì)胞表達(dá)，通過與多種靶蛋白(包括酶，細(xì)胞骨架亞基，受體，轉(zhuǎn)錄因子)的相互作用發(fā)揮細(xì)胞因子和趨化因子作用，激活級(jí)聯(lián)信號(hào)和觸發(fā)細(xì)胞反應(yīng)，從而促進(jìn)

圖 6 p38MAPK通路在 S100A8/A9 蛋白質(zhì)促進(jìn)SCC-25及CAL-27細(xì)胞遷移和侵襲能力中的作用(×400)

腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9在OSCC細(xì)胞間基質(zhì)中的浸潤(rùn)細(xì)胞中表達(dá)，其在組織中表達(dá)量的高低與OSCC轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志[9-10]。近來有研究報(bào)道，骨髓移植后小鼠的腫瘤模型，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的骨髓衍生細(xì)胞表達(dá)的S100A8/A9對(duì)于促進(jìn)腫瘤發(fā)生是必需的[11]。因此，S100A8/A9蛋白可能作為藥物靶點(diǎn),在將來探索新的治療腫瘤的方法將具有重要的臨床價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)觀察到：S100A8/A9蛋白在OSCC細(xì)胞增殖活性中表現(xiàn)為濃度依賴性，高濃度(>35 μg/ml)抑制OSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，低濃度(<35 μg/ml)促進(jìn)OSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，與國(guó)外研究結(jié)果一致，隨后實(shí)驗(yàn)中探究低濃度S100A8/A9蛋白下對(duì)OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲的影響，結(jié)果表明低濃度S100A8/A9蛋白能夠增加OSCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，對(duì)其機(jī)制做了進(jìn)一步探討。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程是一多基因、多因素作用及多步驟過程，研究表明，S100A8/A9 通過與交互模式識(shí)別受體如Toll 樣受體或晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，激活 MAPK 和 NF-kB 信號(hào)通路來調(diào)節(jié)自分泌和旁分泌，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成，從而加快腫瘤的發(fā)展。p38MAPK是MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑之一，p38MAPK激活后磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，激活特定的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)如MMPs,調(diào)控著細(xì)胞的遷移和侵襲[12]; MMPs可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的降解,MMPs表達(dá)量的變少直接導(dǎo)致ECM重構(gòu)，因此也被認(rèn)為是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志[13]，MMPs中其MMP-2和MMP-9是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的良好標(biāo)志，在小鼠肝癌模型中，敲低S100A8和S100A9基因，肝轉(zhuǎn)移灶的MMP-2和MMP-9的表達(dá)量降低[2]。因此，p38MAPK信號(hào)通路被認(rèn)作是腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移中關(guān)鍵的通路,抑制其信號(hào)通路，細(xì)胞的遷移和侵襲也受到影響[14];小鼠腫瘤模型的初步實(shí)驗(yàn)表明，特異性靶向阻斷p38MAPK信號(hào)通路可抑制體內(nèi)肺癌的形成[15]。國(guó)內(nèi)外雖然對(duì)OSCC的遷移和侵襲有一些研究，但其分子機(jī)制尚未明確報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察到：S100A8/A9蛋白能夠增加p-p38MAPK的蛋白表達(dá)量， MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)量也出現(xiàn)上調(diào)，為了進(jìn)一步研究抑制p38MAPK通路后，p-p38MAPK的蛋白表達(dá)量降低，MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)量明顯降低，表明其對(duì)p38MAPK通路有激活作用，同時(shí)在細(xì)胞免疫熒光染色中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)觀察到p-p38MAPK 表達(dá)量增高，隨后在遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，同樣抑制了p38MAPK通路，OSCC細(xì)胞遷移和侵襲能力也隨之減弱，進(jìn)一步驗(yàn)證低濃度S100A8/A9蛋白增加OSCC細(xì)胞遷移和侵襲過程中參與了p38MAPK通路, 提示低濃度S100A8/A9蛋白可能通過激活p38MAPK通路促進(jìn)OSCC細(xì)胞遷移和侵襲。

綜上所述, 低濃度 S100A8/A9蛋白可以促進(jìn)OSCC細(xì)胞遷移和侵襲，其機(jī)理可能是活化了p38MAPK通路。目前S100A8/A9蛋白作為OSCC治療的藥物具有巨大的開發(fā)前景，本研究由于S100A8/A9蛋白復(fù)合物的基因敲除技術(shù)難度高并缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，造成了一定的局限性，本課題組后期將解決這些問題來進(jìn)一步驗(yàn)證。其本次研究的結(jié)果及進(jìn)一步的深入研究將為開發(fā)新的OSCC治療藥物提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。