陸小雨 陳 竹 唐 菲 傅松玲 任 杰(. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程研究所 合肥 3004； . 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院 合肥 30036)

花青素苷是決定植物葉片、花和果實(shí)顏色的呈色物質(zhì)，屬于類黃酮類次生代謝物(Heetal. 2010; Tanakaetal. 2008, Wuetal. 2005)?；ㄇ嗨剀赵饕环譃?種： 矢車菊素苷元、飛燕草素苷元、錦葵花素苷元、天竺葵素苷元、芍藥花素苷元、矮牽?；ㄋ剀赵?Choetal. 2016)。其中，飛燕草素苷元、錦葵花素苷元和矮牽牛花素苷元是很多藍(lán)紫色植物器官的重要呈色物質(zhì)，而天竺葵素苷元和矢車菊素苷元是紅色植物器官中的主要色素。植物葉片開始衰老時葉綠素會發(fā)生降解(Matileetal. 2006)，同時不易降解的花青素和類胡蘿卜素大量積累，葉片變?yōu)榧t色和黃色(Lietal. 2015)。

高通量測序技術(shù)越來越多地被用于植物體內(nèi)代謝物的分子機(jī)制研究(Guoetal. 2017)，代謝組學(xué)將生物體作為一個動態(tài)的整體，通過科學(xué)的數(shù)據(jù)分析技術(shù)，來研究其內(nèi)因或外因?qū)е麓x表觀變化的過程，并建立代謝模型(Raietal. 2017; Riaopachónetal. 2009)，與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等數(shù)據(jù)結(jié)合分析更能直接、真實(shí)反映機(jī)體本身的變化水平。近來，基于組學(xué)的方法為生物體中靜態(tài)和動態(tài)的變化提供了更加深入和廣泛的研究視野(Deshmukhetal.， 2014； Moreno-Risuenoetal.， 2010； Raietal.， 2016)，而多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)可以用來鑒定和分析代謝途徑中單個和多個基因的相互作用(Shenetal. 2016)。例如，Cho等(2016)采用代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)用的方法解析紫色馬鈴薯(Solanumtuberosum)中花青素苷和類黃酮苷的生物合成機(jī)制。

紅花槭(Acerrubrum)，又名北美紅楓，槭屬(Acer)落葉喬木，葉色亮麗、多變，是北美各大城市中主要的觀賞性樹種(Sibleyetal. 1995)。前人在紅花槭的生理(Abrams, 1998; Kalubietal. 2016)、生態(tài)學(xué)特征(Abouzaidetal.， 2001; Alexanderetal. 2010; Williamsetal. 2003)、抗逆性機(jī)制(Nam-Sooetal. 2016; Nkongoloetal. 2018)、功能性天然產(chǎn)物(Geoffroyetal. 2018; Royeretal. 2011)和葉片色素組成(Schmitzeretal. 2009; 馮立娟等, 2008)等方面的研究取得了很大的進(jìn)展。紅花槭具有廣闊的市場前景，其遺傳改良成為研究熱點(diǎn)(任杰等, 2013; 石柏林等, 2006)。然而，對于非模式植物紅花槭的花青素苷生物合成途徑仍不夠清晰，制約了該物種的葉色定向改良和分子育種。

2017年，在安徽省舒城縣發(fā)現(xiàn)一株紅花槭特殊葉色單株，該單株不同枝條上同時存在紅、綠和黃3種顏色的葉片(圖1)，其葉色已連續(xù)2年遺傳穩(wěn)定。本研究選取了該單株上的紅葉、綠葉和黃葉作為試驗(yàn)材料，采用代謝組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)聯(lián)合分析了不同葉色花青素苷的生物合成機(jī)理，旨在為紅花槭葉色的分子改良和遺傳育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年11月下旬于安徽省舒城縣紅花槭培育基地采集紅花槭特殊葉色單株上不同分枝的紅葉、綠葉和黃葉作為試驗(yàn)材料(圖1)。液氮速凍后置于-80 ℃的超低溫冰箱進(jìn)行冷凍保存，備用。

1.2 代謝物提取

50 mg樣本置于EP管中，加入1 000 μL提取劑萃取(乙腈∶甲醇∶水的體積比為2∶2∶1，含內(nèi)標(biāo))。渦旋30 s后，重復(fù)3次均質(zhì)化(45 Hz，4 min)和超聲處理(4 ℃，5 min)，置于-20 ℃冰箱。1 h后取出，4 ℃下離心(12 000 r·min-1，15 min)，所得上清液置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。紅葉、綠葉和黃葉各設(shè)定6個生物學(xué)重復(fù)。質(zhì)控樣本由所有樣本的上清液等量混勻制備(Caietal. 2015； Dunnetal. 2011； Wantetal. 2010)。

圖1 紅花槭特殊葉色單株及取樣示例Fig.1 Red maple with special leaf color and sampling example

1.3 UHPLC-QE-MS進(jìn)行代謝組分析及數(shù)據(jù)處理

LC-MS分析的儀器平臺由Agilent 1290超高效液相色譜串聯(lián)Thermo Fisher Scientific 的Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀組成。所用色譜柱為UPLC HSS T3 色譜柱 (1.7 μm×2.1 mm×100 mm，Waters)。正模式： 流動相A： 0.1%甲酸水溶液； 流動相B： 乙腈。負(fù)模式： 流動相A: 5 mmol·L-1醋酸銨水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0)； 流動相B： 乙腈。

采用Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集。質(zhì)譜參數(shù)條件如下： ESI離子源噴霧電壓3 800 V(正離子模式)或-3 100 V(負(fù)離子模式)； 毛細(xì)管溫度320 ℃； 鞘氣流速45 Arb； 輔助氣流速15 Arb； 掃描范圍70～1 000m/z； 一級分辨率70 000； 二級分辨率17 500； 分步碰撞能量的強(qiáng)度取值3； 分步碰撞能量為20、40、60 eV； 掃描速率7 Hz。 選擇QC 樣本采用Fullms ddMS2方法，分別設(shè)置掃描段范圍： 1)70～200； 2)190～400； 3)390～600； 4)590～1 000。每個掃描段各采集1次，以獲取更多的二級數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定(Wangetal. 2016)。

ProteoWizard將MS原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為mzML格式文件，使用R包XCMS(version 3.2)進(jìn)行進(jìn)一步處理。 結(jié)果是由保留時間(RT)、質(zhì)荷比(m/z)和峰強(qiáng)度組成的數(shù)據(jù)矩陣。對峰強(qiáng)度進(jìn)行積分，所得為各代謝物的積分定量值。 OSI-SMMS(version 1.0)用于MSC數(shù)據(jù)處理后的峰值計(jì)算(Smithetal. 2006)。

R軟件包用于代謝組數(shù)據(jù)的分析和熱圖的制作。對3種顏色的18個葉片樣本進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)。OPLS-DA中篩選模型變量的變量權(quán)重值VIP(variable important in projection)≥1，以及T試驗(yàn)中P<0.05的代謝物作為差異積累代謝物。隨后，使用非商業(yè)數(shù)據(jù)庫KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，www.genome.jp/kegg)和PMN(Plant Metabolic Network，www.plantcyc.org)來分析苯丙氨酸代謝通路、類黃酮代謝通路以及花青素生物合成通路。PCA和OPLS-DA同樣被用于比較關(guān)鍵代謝物之間的具體差異。

1.4 高通量測序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析及數(shù)據(jù)處理

使用RNAprep試劑盒(DP441; Tiangen)分離總RNA樣品，并用NanoPhotometer分光光度計(jì)(IMPLEN，CA，USA)檢查RNA純度。 每種葉色設(shè)定3個生物學(xué)重復(fù)。Qubit?2.0Flurometer(Life Technologies，CA，USA)中的Qubit?RNA Assay Kit用于RNA濃縮，并在1%瓊脂糖凝膠上檢測RNA降解和污染。使用Bioanalyzer 2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies，CA，USA)評估總RNA質(zhì)量。如Pacific Biosciences(PN 100-092-800-03)所述，使用Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit和BluePippin Size Selection System方案，根據(jù)Isoform測序(Iso-Seq)制備Iso-Seq文庫。Clontech SMARTer PCR cDNA合成試劑盒用于第1鏈cDNA合成： 首先將CDS引物IIA退火至轉(zhuǎn)錄物的polyA+尾部，用SMARTScribe TM逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第1鏈合成。將第1鏈產(chǎn)物用洗脫緩沖液(EB)稀釋至合適的體積后用于大規(guī)模PCR。使用SMRTlink 5.0軟件處理序列數(shù)據(jù)。由子讀文件BAM生成CCS，參數(shù)： min_length 200，max_drop_fraction 0.8，no_polish TRUE，min_zscore-999.0，min_passes 1，min_predicted_accuracy 0.8，max_length 18 000。將輸出的CCS.BAM文件使用pbclassify.py進(jìn)行分類，利用ignorepolyA false、minSeqLength 200讀取全長和非全長序列。將生成的全長和非全長fasta文件輸入到群集步驟，該步驟執(zhí)行同種型級別聚類(ICE)，采用如下參數(shù)進(jìn)行最后的數(shù)據(jù)處理： hq_quiver_min_accuracy 0.99，bin_by_primer false，bin_size_kb 1，qv_trim_5p 100，qv_trim_3p 30。使用Illumina RNAseq數(shù)據(jù)和軟件LoRDEC校正共有讀數(shù)中的錯誤核苷酸。通過CD-HIT軟件除去校正的共有讀數(shù)中的冗余，以獲得用于后續(xù)分析的最終轉(zhuǎn)錄本。

基于以下數(shù)據(jù)庫注釋基因功能： NR(NCBI非冗余蛋白質(zhì)序列); NT(NCBI非冗余核苷酸序列); Pfam(蛋白質(zhì)家族); KOG/ COG(直系同源蛋白質(zhì)群); Swiss-Prot(手動注釋和評論的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫); KO(KEGG Ortholog數(shù)據(jù)庫); GO(Gene Ontology數(shù)據(jù)庫)。通過RSEM對每個樣品估計(jì)基因表達(dá)水平(Lietal. 2011)： 1)將無冗余數(shù)據(jù)反映回轉(zhuǎn)錄物序列; 2)從映射結(jié)果中獲得每個轉(zhuǎn)錄物的讀數(shù)。使用DESeq R包(1.10.1)進(jìn)行2個條件/組的差異表達(dá)分析。基于負(fù)二項(xiàng)分布的模型確定數(shù)字基因表達(dá)數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)。使用Benjamini和Hochberg的方法調(diào)整得到的P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。DESeq中P<0.05的基因被指定為差異表達(dá)。用KOBAS軟件測試KEGG途徑中差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集。HTSeq v0.6.1用于計(jì)數(shù)映射到每個基因的讀數(shù)。然后基于基因的長度計(jì)算每個基因的FPKM值(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced， 每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)目)，并將讀數(shù)計(jì)數(shù)映射到該基因(Coleetal. 2010)。

1.5 采用斯皮爾曼相關(guān)分析基因與代謝物之間的網(wǎng)絡(luò)互作

與皮爾森(Pearson)相關(guān)不同，斯皮爾曼(Spearman)相關(guān)用于分析不具有線性關(guān)系的2組數(shù)據(jù)集(Rebekietal.， 2015; Haukeetal.，2011; Sapnaetal.， 2012)。用Graphpad Prism8軟件對綠葉、紅葉、黃葉中花青素代謝通路上差異積累代謝物與差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)集做斯皮爾曼相關(guān)性分析 (Moschenetal.， 2016; Luetal.， 2020; Chenetal.， 2019)，顯著性系數(shù)P<0.05且斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)|r|>0.9被認(rèn)定為2個對象之間具有強(qiáng)相關(guān)性。針對具有強(qiáng)相關(guān)性的差異積累代謝物和差異表達(dá)基因用Cytoscape 3.6.1做網(wǎng)絡(luò)互作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組的多元統(tǒng)計(jì)分析

基于正離子模式(POS)和負(fù)離子模式(NEG)的UHPLC-QE-MS數(shù)據(jù)對紅葉、綠葉和黃葉中不同的代謝物組成進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。主成分分析(PCA)得分圖表示不同樣本原始數(shù)據(jù)的分離程度(Songetal. 2017)。圖2A和B表明紅葉、綠葉和黃葉3個樣本組數(shù)據(jù)的分離程度清晰。正離子模式下，第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)分別占總變量的60.8%和13%； 負(fù)離子模式下，PC1和PC2分別占總變量的63.6%和12.2%。

結(jié)合正交最小偏二乘判別分析(OPLS-DA)的VIP值和單變量統(tǒng)計(jì)分析T檢驗(yàn)P值來篩選不同比較組間的顯著差異代謝物。其中，VIP≥1和T檢驗(yàn)P<0.05被鑒定為顯著差異代謝物。如圖2C和D所示，正、負(fù)離子模式下，分別檢測出2 321個和1 124個無冗余的差異積累代謝物： 正離子模式下，綠葉和紅葉之間檢測出1 377個差異代謝物，綠葉和黃葉之間檢測出1 793個差異代謝物，紅葉和黃葉之間檢測出1 098個差異代謝物； 負(fù)離子模式下，綠葉和紅葉之間檢測出789個差異代謝物，綠葉和黃葉之間檢測出699個差異代謝物，紅葉和黃葉之間檢測出677個差異代謝物。圖2E顯示正離子模式下，綠葉和紅葉之間有706個上調(diào)差異代謝物和671個下調(diào)差異代謝物，綠葉和黃葉之間有537個上調(diào)差異代謝物和1 256個下調(diào)差異代謝物，紅葉和黃葉之間有192個上調(diào)差異代謝物和906個下調(diào)差異代謝物。圖2F顯示負(fù)離子模式下，綠葉和紅葉之間有355個上調(diào)差異代謝物和434個下調(diào)差異代謝物，綠葉和黃葉之間有141個上調(diào)差異代謝物和558個下調(diào)差異代謝物，紅葉和黃葉之間有70個上調(diào)差異代謝物和607個下調(diào)差異代謝物。

圖2 紅葉(RL)、綠葉(GL)和黃葉(YL)的PCA得分圖(A, B)、差異代謝物韋恩圖(C, D)和上/下調(diào)差異代謝物統(tǒng)計(jì)圖(E,F)Fig.2 PCA score plots(A, B), Venn diagram of differential metabolites(C, D), and up-/down-regulated metabolites statistics(E,F) of red leaves (RL), green leaves (GL), and yellow leaves (YL)QC： 質(zhì)控樣本； POS： 正離子模式； NEG： 負(fù)離子模式。QC： Quality control; POS: Positive mode; NEG: Negative mode.

2.2 花青素苷差異代謝物分析

將鑒定出的紅花槭中花青素苷相關(guān)代謝物與KEGG數(shù)據(jù)庫的相關(guān)代謝物進(jìn)行比對分析， 并將其分配至花青素苷合成途徑中的相應(yīng)位置。在花青素苷合成的初始階段，查爾酮合成酶(CHS)催化對香豆酰輔酶A(p-coumaroyl-CoA)生成查爾酮(chalcone)，查爾酮進(jìn)一步被查爾酮異構(gòu)酶(CHI)異構(gòu)為柚皮素(naringenin)，接著柚皮素在黃烷酮-3-羥化酶(F3H)的催化下于3號位加入1個羥基生成二氫山奈酚(dihydrokaempferol，DHK)，二氫山奈酚被黃烷酮-3′-羥化酶(F3′H)和黃烷酮-3′,5′-羥化酶(F3′5′H)分別催化生成二氫槲皮素(dihydroquercetin，DHQ)和二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)。此后，花青素苷的合成分為3個分支： 二氫山奈酚、二氫槲皮素和二氫楊梅素分別被二氫黃烷酮-4-還原酶(DFR)催化生成不同的無色花青素苷元(leucoanthocyanidins)——二氫山奈酚催化成原天竺葵素苷元(leucopelargonidin)，二氫槲皮素生成原矢車菊素苷元(leucocyanidin)，二氫楊梅素生成原飛燕草素苷元(leucodelphindin)。最終，3種原花青素苷元被花青素苷合成酶(ANS)催化分別生成橙紅色的天竺葵素苷元(pelargonidin)、矢車菊素苷元(cyanidin)和飛燕草素苷元(delphindin)。這些花青素苷元可以被甲基化、糖基化和?；刃揎棾刹煌摹⒔Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定的花青素苷衍生物。圖3是根據(jù)每個代謝物的積分定量值所作的熱圖分析。如圖所示，紅葉中花青素苷及其衍生物的積累量明顯高于綠葉、黃葉的積累量，這表明其對紅花槭的葉片色素形成起著關(guān)鍵作用?；ㄇ嗨剀昭苌锎a和名稱如表1所示。在花青素苷合成的第1階段(圖4第1階段)，柚皮素和DHK在紅葉中大量的積累。雖然黃葉中的柚皮素的積累量在3種顏色的葉片中最高，但是其DHK的積累量很低。在花青素苷合成的第2階段(圖4第2階段)，紅葉與綠葉相比，積累了更多的無色黃酮醇(槲皮素、山奈酚和楊梅素)，但黃葉中的這3種黃酮醇的含量要低于綠葉。在花青素苷合成的第3階段(圖4第3階段)，紅葉和黃葉中的兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、飛燕草素苷、矢車菊素苷衍生物、天竺葵素苷衍生物和飛燕草素苷衍生物的積累量都高于綠葉，在3種顏色的葉片中，黃葉中含最多的沒食子兒茶素，紅葉中沒食子兒茶素的含量最少，綠葉中含有最多的無色矢車菊素苷元和飛燕草素苷衍生物。

圖3 紅葉 (RL)、綠葉 (GL) 和黃葉 (YL) 中與花青素苷合成相關(guān)代謝物的熱圖分析Fig.3 Heat maps of anthocyanidin-related metabolites of red leaves (RL), green leaves (GL), and yellow leaves (YL)

表1 花青素苷衍生物名稱Tab.1 Name of anthocyanin derivatives

圖4 紅葉、綠葉和黃葉中花青素苷合成途徑上相關(guān)基因和代謝物的細(xì)節(jié)展示Fig.4 Detailed portion of the anthocyanin biosynthesis pathway that reveals the various expressions of related genes and different contents of metabolitesCHS: 查爾酮合成酶； CHI: 查爾酮異構(gòu)酶； F3H: 黃烷酮3-羥化酶； F3′H: 黃烷酮3′-羥化酶； F3′5′H: 黃烷酮3′5′-羥化酶； DFR: 二氫黃酮醇4-還原酶； ANS: 花青素苷合成酶； UFGT: 類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶； FLS: 黃酮醇合成酶； LAR: 原花青素苷元還原酶； ANR: 花青素苷還原酶。P-Coumaroyl-CoA： 對肉桂酸輔酶A； Naringenin chalcone： 柚皮素查爾酮； Naringenin： 柚皮素； DHK： 二氫山奈酚； DHQ： 二氫槲皮素； DHM： 二氫楊梅素； Quercetin： 槲皮素； Kaempferol： 山奈酚； Myricetin： 楊梅素； Leucocyanidin： 原矢車菊素苷元； Leucopelargonidin： 原天竺葵素苷元； Leucodelphnidin： 原飛燕草素苷元； Catechin： 兒茶素； Afzelechin： 阿福豆素； Gallocatechin： 沒食子兒茶素； Cy: 矢車菊素苷； Pg: 天竺葵素苷； Del: 飛燕草素苷； Epicatechin： 表兒茶素； Epiafzelechin： 表阿福豆素； Epigallocatechin：表沒食子兒茶素； Cy-3-glucoside：矢車菊素-3-葡糖苷； Pg-3-glucoside： 天竺葵素-3-葡糖苷； Del-3-glucoside： 飛燕草素-3-葡糖苷。CHS: Chalcone synthase; CHI: Chalcone isomerase; F3H: Flavanone 3-hydroxylase; F3′H: Flavanone 3′-hydroxylase; F3′5′H: Flavanone 3′,5′-hydroxylase; DFR: Dihydroflavonol 4-reductase; ANS: Anthocyanidin synthase; UFGT: Flavonoid 3-O-glucosyltransferase; FLS: Flavonol synthase; LAR: Leucoanthocyanidin reductase; ANR: Anthocyanidin reductase; DHK: Dihydrokaempferol; DHQ: Dihydroquercetin; DHM: Dihydromyricetin; Cy: Cyanidin； Pg: Pelargonidin； Del: Delphinidin.

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

轉(zhuǎn)錄組測序中共檢測出49 521個無冗余的差異表達(dá)基因。紅葉-綠葉比較組中有14 009個差異表達(dá)基因上調(diào)，14 527個差異表達(dá)基因下調(diào)； 黃葉-綠葉比較組中有20 824個差異表達(dá)基因上調(diào)，22 193個差異表達(dá)基因下調(diào)； 紅葉-黃葉比較組中有13 620個差異表達(dá)基因上調(diào)，13 490個差異表達(dá)基因下調(diào)(圖5A, B)。KEGG富集分析顯示，在紅葉-綠葉、紅葉-黃葉比較組中，苯丙氨酸合成通路和類黃酮合成通路都為顯著富集通路(校正P≤1)，而在黃葉-綠葉比較組中，這2個通路并沒有表現(xiàn)出顯著富集(表2)?；诨ㄇ嗨剀障嚓P(guān)的差異表達(dá)基因的FPKM值做熱圖(圖5C)分析，71.4%差異表達(dá)基因在紅葉中表達(dá)量最高，包括CHS,CHI,F3H,F3′H,DFR,ANS,ANR,LAR和UFGT。綠葉中，CHS8,FLS2和UFGT3的表達(dá)量高于紅葉和黃葉。UFGT5在黃葉中的表達(dá)量高于紅葉和綠葉。紅葉與綠葉相比，花青素苷合成通路上89.5%的差異基因表達(dá)量上調(diào)； 黃葉與綠葉相比，花青素苷合成通路上66.7%的差異基因表達(dá)量上調(diào)。在花青素苷合成的第1階段(圖4第1階段)，從基因的角度，盡管紅葉中的CHS1,CHS2,CHS6和CHS8基因的表達(dá)量比綠葉中的低，但是紅葉中大部分的CHS基因、2個CHI基因和11個F3H基因與綠葉相比都表現(xiàn)出較高的表達(dá)量。黃葉中的6個CHS基因(CHS3,CHS4,CHS5,CHS7,CHS9和CHS10)和11個F3H基因的表達(dá)量比綠葉中的高，相反，所有CHI基因的表達(dá)量較綠葉都呈現(xiàn)出較低的表達(dá)。在花青素苷合成的第2階段(圖4第2階段)，在基因方面，紅葉和黃葉中的FLS1的表達(dá)量都比綠葉中高，但是其中的FLS2的表達(dá)量比綠葉中的低。在3種顏色的葉片中，紅葉中所有的F3′H和DFR基因的表達(dá)量最高。DFR1和DFR3在黃葉中表達(dá)較高，但是黃葉中DFR2的表達(dá)量低于綠葉。在花青素苷合成的第3階段(圖4第3階段)，在基因方面，紅葉和黃葉中除了UFGT3基因以外，所有的基因都較綠葉有著更高的表達(dá)。

圖5 紅葉(RL)、綠葉(GL)、黃葉(YL)不同比較組間差異表達(dá)基因的韋恩圖(A)、差異表達(dá)基因上/下調(diào)統(tǒng)計(jì)圖(B)和差異表達(dá)基因熱圖分析(C)Fig.5 Venn diagram (A), differentially expressed gene up/down regulation (B) and differentially expressed gene heat map analysis(C) of red leaf (RL), green leaf (GL) and yellow leaf (YL)

表2 不同比較組間顯著富集KEGG通路(修正P≤0.01)Tab.2 Significantly enriched KEGG pathways in different comparison groups (corrected P≤0.01)

續(xù)表2Continued

編號No.通路名稱Pathway通路IDPathway ID通路注釋的差異表達(dá)基因DEGs with pathway annotation通路注釋的所有基因All genes with pathway annotationP修正P值Corrected P24二苯乙烯類、二芳基庚烷類和姜辣素類的生物合成Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesisko0094527420.001 955 2620.009 939 251綠葉-黃葉Green leaves-yellow leaves1核糖體Ribosomeko030103224411.91E-132.33E-112卟啉和葉綠素代謝Porphyrin and chlorophyll metabolismko008601361935.56E-060.000 339 316紅葉-黃葉 Red leaves-yellow leaves1類黃酮生物合成Flavonoid biosynthesisko00941731021.82E-102.22E-082苯丙烷類生物合成Phenylpropanoid biosynthesisko009401082143.92E-082.39E-063甘油脂代謝Glycerolipid metabolismko005612025201.16E-064.73E-054調(diào)節(jié)自噬Regulation of autophagyko041401182872.67E-050.000 812 8525核糖體Ribosomeko030101644416.85E-050.001 671 0126淀粉和蔗糖代謝Starch and sucrose metabolismko005003701 1490.000 168 5900.003 427 9877苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesisko00400781860.000 350 2920.005 966 4808糖胺聚糖降解Glycosaminoglycan degradationko0053123330.000 391 2450.005 966 4809N-聚糖生物合成N-glycan biosynthesisko00510751820.000 664 7220.009 010 67610果糖和甘露糖代謝Fructose and mannose metabolismko000511133040.000 842 4260.009 555 40811萜類骨架生物合成Terpenoid backbone biosynthesisko00900671600.000 896 1560.009 555 40812脂肪酸延伸率Fatty acid elongationko0006225410.000 939 8760.009 555 408

2.4 花青素苷相關(guān)代謝物與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析

對紅花槭花青素苷合成通路上的相關(guān)差異積累代謝物和差異表達(dá)基因進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)性分析。在花青素苷合成通路中，共有14個差異表達(dá)基因與6個差異積累代謝物具有強(qiáng)烈的相關(guān)性(圖6)。絕大多數(shù)基因(CHS2，CHS7，CHS8，F(xiàn)3H1，F(xiàn)3H5，F(xiàn)3H7，F(xiàn)3H8，F(xiàn)3H10，F(xiàn)3′H2，LAR，F(xiàn)LS1，F(xiàn)LS2，UFGT4)均與天竺葵素苷衍生物和飛燕草素苷衍生物之間存在負(fù)相關(guān)，說明這些基因可能逆向調(diào)控天竺葵素苷衍生物和飛燕草素苷衍生物的合成，而UFGT5與矢車菊素-3-阿拉伯糖苷之間存在正相關(guān)則說明UFGT5正向調(diào)控矢車菊素苷衍生物的合成。

圖6 紅花槭中與花青素苷合成相關(guān)的基因和代謝物的網(wǎng)絡(luò)互作Fig.6 Strong correlations between anthocyanin biosynthesis-related genes and anthocyanin-related metabolites in red mapleCHS: 查爾酮合成酶編碼基因; F3H: 黃烷酮3-羥化酶編碼基因; F3′H: 黃烷酮3′-羥化酶編碼基因; UFGT: 類黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因; LAR: 原花青素苷元還原酶編碼基因; FLS: 黃酮醇合成酶編碼基因; Catechin: 兒茶素; Epigallo catechin: 表沒食子兒茶素。 代謝物Pg-Gsy, Del-S, Del-M-Glu, Cy-Arab 名稱見表1。CHS: Chalcone synthase encoding gene; F3H: Flavanone 3-hydroxylase encoding gene; F3′H: Flavanone 3′-hydroxylase encoding gene; UFGT: Flavonoid 3-O-glucosyltransferase encoding gene; LAR: Leucoanthocyanidin reductase encoding gene; FLS: Flavonol synthase encoding gene. The metabolites Pg-Gsy, Del-S, Del-M-Glu, Cy-Arab are shown in Tab. 1.

3 討論

為了探討紅花槭葉片變色期間花青素苷代謝物和相關(guān)基因的變化規(guī)律，下面將以綠葉作為對照組，討論相關(guān)基因和代謝物在3種顏色的葉片中協(xié)同作用的差異。

前人的研究表明，查爾酮合成酶(CHS)縮合對香豆酰輔酶A，并使丁烯酮分子內(nèi)環(huán)化形成柚皮素查爾酮(2′，4，4′，6′-四羥基查爾酮)(Koesetal. 2005; 1989)。非洲菊(Gerberahybrida)的CHS基因的表達(dá)水平與花青素苷的合成呈正相關(guān)(Dengetal. 2014)。查爾酮異構(gòu)酶迅速催化柚皮素查爾酮，使其立體特異性環(huán)化成柚皮素(Naringenin)(Kuittinenetal. 2000; Shimadaetal. 2003)。用RNA干擾技術(shù)抑制矮牽牛(Petuniahybrida)中CHI的表達(dá)，使其花色變淡，花瓣中的花青素苷含量降低(Chuetal. 2015)。F3H基因作用在柚皮素3號位(Kumaretal. 2015)，催化立體特異性羥基化反應(yīng)，形成后續(xù)花青素苷合成的關(guān)鍵物質(zhì)DHK (Hanetal. 2017)。在本研究的3種顏色的葉片中，花青素苷合成的第1階段(圖4第1階段)，對香豆酰輔酶A和柚皮素查爾酮的含量極低，一個可能的解釋是這2種物質(zhì)因其不穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)而在葉片中存在的時間非常短暫，以至于無法被檢測出——對香豆酰輔酶A一旦形成就會迅速轉(zhuǎn)化成柚皮素查爾酮，接著被迅速催化形成柚皮素。因此，可以推斷當(dāng)綠葉變紅時，花青素苷合成的第1階段的所有基因的表達(dá)量增加，導(dǎo)致柚皮素和DHK的大量積累。類似地，當(dāng)綠葉變黃時，大多數(shù)CHS基因和所有的F3H基因表達(dá)量增加，而CHI基因的表達(dá)量降低，黃葉中的柚皮素含量最高，但是黃葉中DHK含量在3種顏色葉片中最低，其原因可能是大多數(shù)F3H基因在類黃酮通路的其他分支發(fā)揮著催化作用，Springob等(2003)報(bào)道了F3H基因在除花青素苷合成之外的其他類黃酮支路發(fā)揮著催化作用。

F3′H和F3′5′H分別通過催化DHK使其羥基化而形成2R,3R-二氫槲皮素(DHQ)和2R,3R-二氫楊梅素(DHM)(Tanakaetal. 2008)，這使得F3′H和F3′5′H成為確定B環(huán)黃酮類產(chǎn)物和花青素苷羥基化進(jìn)程的關(guān)鍵酶(Heetal. 2013)。DFR催化3種二氫黃酮醇(DHK, DHQ和DHM)并生成相應(yīng)的無色原花青素苷元(原天竺葵素苷元，原矢車菊素苷元，原飛燕草素苷元)，F(xiàn)LS的作用在于催化二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化為3種不同的黃酮醇(槲皮素、山奈酚和楊梅素)，Davies等(2003)報(bào)道了FLS分支會逆向調(diào)節(jié)花青素苷的合成，Qian等(2014)的研究發(fā)現(xiàn)葡萄風(fēng)信子(Muscariarmeniacum)中作用在DHM上的DFR和FLS之間有著很強(qiáng)烈的競爭關(guān)系。與第1階段的對香豆酰輔酶A和柚皮素查爾酮一樣，在紅花槭花青素苷合成的第2階段(圖4 第2階段)并未檢測到DHM、DHQ、原天竺葵素苷元和原飛燕草素苷元的原因可能在于它們不穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)。當(dāng)綠葉衰老時，F(xiàn)LS1的表達(dá)量增加，F(xiàn)LS2的表達(dá)量減少，在此趨勢的影響下，紅葉本應(yīng)該與綠葉含有等量的槲皮素、山奈酚和楊梅素，但是本研究的結(jié)果顯示紅葉中的這3種物質(zhì)的積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于綠葉，這可能在于紅葉在第1階段中產(chǎn)生的DHK多于綠葉造成的。同樣地，第1階段積累了較少量的DHK，這使得黃葉中槲皮素、山奈酚和楊梅素含量也較少。此外，綠葉開始衰老后，紅葉和黃葉中的DFR基因表達(dá)呈上升趨勢。

前人對于第3階段(圖4第3階段)的相關(guān)基因做了大量的研究：ANS催化原花青素苷元合成有色花青素苷的前體物質(zhì)(Tanakaetal. 2008)。過表達(dá)純化后的紫蘇(Perillafrutescens)ANS，使得在HCl酸化環(huán)境中有更多的原花青素苷元轉(zhuǎn)化成花青素苷(Kitadaetal. 2001)。UFGT可以在3-O-位置糖基化花青素苷使其變得更加穩(wěn)定(Fordetal. 1998)。UFGT基因正向調(diào)節(jié)花青素苷合成的現(xiàn)象已經(jīng)在多種植物中被報(bào)道，包括甜橙(Citrussinensis)(Pieroetal. 2005)、葡萄(Vitisvinifera)(Kobayashietal. 2001)、紫色馬鈴薯(Huetal. 2011)，而在本研究中圖4和表2的結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。LAR催化原花青素苷元合成相應(yīng)的類黃酮產(chǎn)物(兒茶素、阿福豆素和沒食子兒茶素)，ANR催化還原花青素苷元并相應(yīng)地合成表兒茶素、表阿福豆素和表沒食子兒茶素。夏濤等(2009)報(bào)道了LAR和ANR表達(dá)量上調(diào)導(dǎo)致了茶葉中原花青素苷(兒茶素和表兒茶素的結(jié)合產(chǎn)物)的含量增加。Liu等(2013)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)突變體上過表達(dá)了可可樹(Theobromacacao)的ANR基因，導(dǎo)致其下胚軸中花青素苷的含量降低。由此可以發(fā)現(xiàn)LAR和ANS之間、ANR和UFGT之間存在競爭的關(guān)系。本研究中未檢出阿福豆素和表阿福豆素，原因可能在于LAR催化無色天竺葵素苷元以及ANR催化天竺葵素苷的過程被阻斷。如上所述，ANR和UFGT催化3種花青素苷分別生成相應(yīng)的類黃酮產(chǎn)物和花青素苷衍生物，除此之外，還有一部分未反應(yīng)完全的花青素苷被積累。圖7A，B，C表明，紅葉、綠葉和黃葉中花青素苷和類黃酮產(chǎn)物的含量之間都存在此消彼長的趨勢。3種顏色的葉片中，對于矢車菊素苷來說，被UFGT催化生成的矢車菊素苷衍生物的含量比被ANR催化而成的表兒茶素含量高，矢車菊素苷反應(yīng)完全； 對于天竺葵素苷來說，被ANR催化而生成表阿福豆素的分支被阻斷，除了被催化生成的部分天竺葵素苷衍生物之外，還有部分未反應(yīng)完全的天竺葵素苷被積累下來； 對于飛燕草素苷來說，被UFGT催化而成的飛燕草素苷衍生物的含量比被ANR催化而成的表沒食子兒茶素含量低。其原因可能與ANR和UFGT在化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的不同底物中競爭優(yōu)勢的差異有關(guān)?；诨ㄇ嗨剀蘸铣傻牡?階段的結(jié)果可知，一旦綠葉開始衰老，第3階段中幾乎所有基因的表達(dá)量都呈現(xiàn)上升趨勢。經(jīng)過一系列復(fù)雜的催化反應(yīng)之后，不同色素的相互作用使綠葉變?yōu)辄S色或者紅色。本研究中未檢出矢車菊素苷單體，但是檢測出6種矢車菊素苷的衍生物——矢車菊素-3-(4-乙酰葡萄糖苷)、矢車菊素-3-(6″-乙酰半乳糖苷)、矢車菊素-O-(吡喃木糖基-羥基肉桂基-吡喃葡萄糖基)、矢車菊素-3-桑布雙糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-昆布雙糖苷，這與李玲(2013)的研究中紅花槭中決定性色素是矢車菊素單體和矢車菊素-半乳糖苷不同，造成這種差異可能是由于流動相不同。矢車菊素苷衍生物在酸性較強(qiáng)的流動相中糖苷鍵斷裂，從而生成矢車菊素苷單體(Zhengetal. 2003)； 本研究代謝組檢測試驗(yàn)中采用的UHPLC-Q-E-MS方法中流動相為0.1%甲酸、5 mmol·L-1乙酸銨，酸性較弱，矢車菊素衍生物不易發(fā)生水解，導(dǎo)致檢測出不同的矢車菊素衍生物，而矢車菊素單體無法被檢測出。如圖7D所示，當(dāng)綠葉變紅時，深紅色的矢車菊素苷衍生物、橙紅色的天竺葵素苷和天竺葵素苷衍生物、藍(lán)紫色的飛燕草素苷和飛燕草素苷衍生物的含量顯著增加； 當(dāng)綠葉變黃時，矢車菊素苷衍生物、飛燕草素苷和飛燕草素苷衍生物含量增加，而天竺葵素苷和天竺葵素苷衍生物含量減少。3種類型的色素在紅葉中的含量最高，這使得紅葉呈現(xiàn)出較黃葉更深的對比色。值得注意的是，矢車菊素苷衍生物在紅葉和黃葉中的積累量均高于其他2種類型色素的積累量，而在檢測出的6種矢車菊素苷衍生物中，紅葉和黃葉中矢車菊素-3-(6″-乙酰半乳糖苷)和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷的含量顯著高于其他4種衍生物的含量(圖8)，由此可以推斷出矢車菊素苷衍生物是紅花槭葉片衰老后葉色的決定性因素。

圖7 紅葉(A)、綠葉(B)、黃葉(C)中花青素苷、花青素苷衍生物和類黃酮產(chǎn)物的含量及3種顏色的葉片中花青素苷類色素的含量(D)Fig.7 Content of anthocyanidins, anthocyanidin derivatives, and flavonoid products in red leaves(A), green leaves(B), yellow leaves(C) and content of three types of anthocyanidin-related pigments in red, green, and yellow leaves(D)RL： 紅葉； GL： 綠葉； YL： 黃葉； CYR： 矢車菊素苷元相關(guān)反應(yīng)； PGR： 天竺葵素苷元相關(guān)反應(yīng)； DELR： 天竺葵素苷元相關(guān)反應(yīng)； R-A： 剩余花青素苷元； A-D： 花青素苷衍生物； F-P： 類黃酮產(chǎn)物； Cy-D: 矢車菊素苷衍生物； Pg-D： 天竺葵素苷衍生物； Del-D： 飛燕草素苷衍生物。RL: Red leaves; GL: Green leaves; YL: Yellow leaves; CYR: Cyanidin reactions; PGR: Pelargonidin reactions; DELR: Delphinidin reactions; R-A: Residual anthocyanidin; A-D: Anthocyanidin derivatives; F-P: Flavonoid product; Cy-D: Cyanidin derivatives; Pg-D: Pelargonidin derivatives; Del-D: Delphinidin derivatives.

圖8 綠葉(GL)、紅葉(RL)、黃葉(YL)中不同矢車菊素苷衍生物的含量Fig.8 Content of different cyanidin derivatives in green leaves(GL), red leaves(RL) and yellow leaves(YL)代碼見表1。The code is shown in Tab. 1.

4 結(jié)論

本文通過代謝組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析，研究了紅花槭紅葉、黃葉、綠葉中花青素苷合成相關(guān)的基因表達(dá)和代謝物積累的變化情況，用紅花槭特殊葉色單株，從代謝組和轉(zhuǎn)錄組的視角闡明綠葉在衰老后變黃或者變紅的分子機(jī)制。當(dāng)該單株的綠葉變紅時，花青素苷合成通路中89.5%的基因表達(dá)量增加，變黃時則有66.7%的差異基因表達(dá)量增加，矢車菊素-3-(6″-乙酰半乳糖苷)和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷的含量大幅上升，是葉片變色的主要驅(qū)動因子。然而，紅花槭中花青素苷的合成包含著非常復(fù)雜的生物過程和相互作用機(jī)制，未來的研究將關(guān)注其花青素苷合成途徑上關(guān)鍵代謝物和關(guān)鍵基因的功能性研究。隨著基因工程被廣泛應(yīng)用于觀賞植物的遺傳育種，該研究可為紅花槭的葉色定向改良提供科學(xué)的理論依據(jù)。