林上陽(yáng) 周雅倩 謝輝 李偉東

摘要?目的：研究杜仲Eucommia ulmoides Oliv.極細(xì)粉與傳統(tǒng)飲片的體外溶出度及其在大鼠體內(nèi)的生物利用度，揭示杜仲極細(xì)粉碎后主要活性成分的體內(nèi)外溶出的變化，為杜仲極細(xì)粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。方法：激光粒度分析儀測(cè)定杜仲極細(xì)粉的粒徑;HPLC法測(cè)定杜仲極細(xì)粉與傳統(tǒng)飲片有效成分在不同溶出介質(zhì)中溶出度。UPLC-MS/MS測(cè)定杜仲京尼平苷酸的血藥濃度變化。結(jié)果：杜仲極細(xì)粉有效成分溶出總量都顯著高于杜仲傳統(tǒng)飲片（P<0.05），杜仲傳統(tǒng)飲片有效成分的溶出度和溶出速率均低于極細(xì)粉（P<0.05）。京尼平苷酸在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)符合二室模型，權(quán)重為1，高劑量極細(xì)粉組和高劑量水煎液組的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為MRT（0-t）=（241.498±20.678）min和（135.084±13.571）min;Tmax=（132±26.833）min和（65±12.247）min;Cmax=（231.8±80.111）μg/L和（435.167±208.696）μg/L;AUC（0-t）=（61 947.696±27 073.105）μg/（L·min）和（63 212.803±31 981.087）μg/（L·min）;AUC（0-∞）=（62 327.808±27 079.977）μg/（L·min）和（63 910.596±31 686.357）μg/（L·min）。結(jié)論：杜仲極細(xì)粉碎后能顯著增加有效成分的溶出度和顯著提高有效成分的溶出速率，且可以增加京尼平苷酸在大鼠體內(nèi)的停留時(shí)間。杜仲傳統(tǒng)飲片制備成極細(xì)粉具備可行性。

關(guān)鍵詞?杜仲;極細(xì)粉;傳統(tǒng)飲片;溶出度;生物利用度;京尼平苷酸;高效液相色譜法;超高效色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Abstract?Objective：To study the in vitro dissolution rate of Eucommia ulmoides Oliv.ultrafine powder and traditional decoction pieces and its bioavailability in rats，and to reveal the changes in the in vivo and in vitro dissolution of the main active ingredients of Eucommia ulmoides Oliv.The formulation of quality standards provides a scientific basis.Methods：Laser particle size analyzer was used to determine the particle size of Eucommia ulmoides ultrafine powder; HPLC method was used to determine the dissolution of the effective components of Eucommia ulmoides ultrafine powder and traditional decoction pieces in different dissolution media.UPLC-MS/MS was used to determine the blood concentration of Eucommia geniposide.Results：The total dissolution of active ingredients of Eucommia ulmoides extra-fine powder was significantly higher than that of traditional eucommia ulmoides（P<0.05）.The dissolution rate and dissolution rate of active ingredients of eucommia ulmoides traditional decoction pieces were lower than those of ultrafine powder（P<0.05）.The plasma concentration-time data of geniposide in rats conformed to the two-compartment model，with a weight of 1.The main pharmacokinetic parameters of the high-dose ultrafine powder group and the high-dose decoction group were MRT（0-t）=（241.498±20.678）and（135.084±13.571）min; Tmax=（132±26.833）and（65±12.247）min; Cmax=（231.8±80.111）and（435.167±208.696）μg/L; AUC（0-t）=（61 947.696±27 073.105）and（63 212.803±31 981.087）μg/（L·min）; AUC（0-∞）=（62 327.808±27 079.977）and（63 910.596±31 686.357）μg/（L·min）.Conclusion：Eucommia ulmoides can significantly increase the dissolution rate of the active ingredients and the dissolution rate of the active ingredients after extremely fine pulverization，and can increase the residence time of geniposide acid in rats.Traditional decoction pieces of Eucommia ulmoides can be prepared into very fine powder.

Keywords?Eucommia ulmoides; Ultra-fine powder; Traditional decoction pieces; Dissolution; Bioavailability; Geniposide acid; High performance liquid chromatography; Ultra performance chromatography-tandem mass spectrometry（Chinese keywords please use Chinese）

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.006

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv的干燥樹(shù)皮，是我國(guó)一種名貴珍稀的滋補(bǔ)類藥材，有補(bǔ)肝腎、安胎、強(qiáng)筋骨等功效[1-2]。杜仲作為一種皮類藥材，其皮中獨(dú)有的細(xì)密、富彈性的橡膠絲決定其有效成分比較難于溶出[3]，超微粉碎技術(shù)是一種利用機(jī)械或流體動(dòng)力的方法，把原材料加工成微米級(jí)甚至納米級(jí)的超微粉的技術(shù)方法，使藥材比表面積增加，孔隙率增大，使有效成分的溶出速度和溶出率提高，從而加快起效速度并增強(qiáng)療效[4];利用超微粉碎技術(shù)，用小于原處方的藥量即可獲得原處方的療效[5]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC法測(cè)定杜仲極細(xì)粉與傳統(tǒng)飲片中的有效成分京尼平苷酸（GPA）、京尼平（GP）和松脂醇二葡萄糖苷（PDG）在3種不同溶出介質(zhì)中的溶出行為[6]，采用UPLC-MS/MS測(cè)定大鼠體內(nèi)京尼平苷酸的血藥濃度，比較杜仲級(jí)細(xì)分和傳統(tǒng)飲片在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以期揭示杜仲經(jīng)極細(xì)粉碎后主要成分在體外和體內(nèi)的變化規(guī)律及其生物利用度，為杜仲極細(xì)粉的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?貝利微粉機(jī)（濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司，型號(hào)：BFM-T6BI）;超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ-500E）;多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司，型號(hào)：2000Y）;萬(wàn)分之一天平（日本島津公司，日本，型號(hào)：ATY 124）;激光粒度分析儀（貝克曼庫(kù)爾特有限公司，美國(guó)，型號(hào)：LS 13320）;高效液相色譜儀（配備PDA檢測(cè)器，Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：Waters e2695）;智能溶出試驗(yàn)儀（天津天大天發(fā)科技有限公司，型號(hào)：ZRS-8G）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi有限公司，瑞士，型號(hào)：R100）;離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：Mirocl 17）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：DHG-9140A）;旋蒸儀（Buchi有限公司，瑞士，型號(hào)：R210）;試管振蕩器（Heidolph有限公司，德國(guó)，型號(hào)：Multi Reax）;真空離心濃縮儀（Labconco CentriVap，美國(guó)，型號(hào)：CentriVap Complete Vacuum Concentrators）;液相色譜輸液泵（日本島津公司，日本，型號(hào)：LC-10ATvp）;MS系統(tǒng)三重四級(jí)桿色譜儀（AB Sciex公司，美國(guó)，型號(hào)：AB5500）。

1.2?試劑?京尼平苷酸對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，南京世洲生物科技有限公司，批號(hào)：27741-01-1）;京尼平對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，南京世洲生物科技有限公司，批號(hào)：6902-77-8）;松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，南京世洲生物科技有限公司，批號(hào)：63902-38-5）;葛根素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，南京世洲生物科技有限公司，批號(hào)：20180203）;胃蛋白酶（酶活力1∶10 000，100 g，福建飛凈生物科技有限公司，批號(hào)：181015）;胰蛋白酶（酶活力1∶250，100 g，福建飛凈生物科技有限公司，批號(hào)：181015）;氫氧化鈉（分析純，500 g，南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10091721035）;磷酸二氫鉀（分析純，500 g，廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)：20140520）;鹽酸（分析純，4 L，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140220）;甲醇（色譜純，4 L，Tedia Company，美國(guó)，批號(hào)：20035159）;甲酸（色譜純，500 mL，Acslabchem，美國(guó)，批號(hào)：C10332080）。

1.3?分析樣品?杜仲藥材（采購(gòu)于四川成都，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為杜仲科植物Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹(shù)皮），生產(chǎn)日期分別為2017年2月4日（第1批批號(hào)：20170204）、2017年4月22日（第2批批號(hào)：20170422）、2017年6月5日（第3批批號(hào)：20170605）。

1.4?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（浙）2004-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)在飼養(yǎng)溫度為20 ℃，相對(duì)濕度為60%，每天光照12 h的環(huán)境中。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心，所有動(dòng)物相關(guān)研究均符合南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的管理準(zhǔn)則（倫理審批號(hào)：201903A011）。

2?方法與結(jié)果

2.1?杜仲極細(xì)粉的制備及粒度測(cè)定?利用超微粉碎機(jī)將經(jīng)預(yù)粉碎后的杜仲普通粉體進(jìn)行粉碎，得到杜仲極細(xì)粉。實(shí)驗(yàn)中為探究極細(xì)粉與傳統(tǒng)飲片體外溶出差異而設(shè)置了3個(gè)不同批次，分別為20170204、20170422和20170603。利用激光粒度儀測(cè)定上述3批杜仲極細(xì)粉的粒徑，繪制出以體積為基準(zhǔn)的粒徑頻率分布圖，得到各極細(xì)粉的D10值、中位徑D50值和D90值，各粒徑結(jié)果如表1。

2.2?杜仲極細(xì)粉有效成分溶出總量的測(cè)定

2.2.1?色譜條件?Kromasil 100-5-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：0.1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，95%～82%A;5～15 min，82%～81%A;15～28 min，81%～77%A;28～44 min，77%～75%A;44～54 min，77%～74%A）;流速1 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL;京尼平苷酸和京尼平的檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，松脂醇二葡萄糖苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm。在上述色譜條件下，各色譜峰分離度良好。

2.2.2?對(duì)照品溶液的制備?分別精密稱取京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷的對(duì)照品各1.78、0.96、3.48 mg，置于10 mL的量瓶中，再加甲醇定容為分別含京尼平苷酸0.178 mg/mL、京尼平0.096 mg/mL、松脂醇二葡萄糖苷0.348 mg/mL的溶液，制得對(duì)照品溶液。

2.2.3?供試品溶液的制備?取3個(gè)不同生產(chǎn)批次分別編號(hào)為（20170204、20170422、20170603）的杜仲極細(xì)粉和傳統(tǒng)飲片，一式3份，精密取1 g粉末，置于50 mL具塞圓底燒瓶中，精密加入純水20 mL，稱重，將燒瓶放在溫度為100 ℃的恒溫水浴鍋中回流提取1 h，放冷，再稱重，用純水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2.2.4?專屬性試驗(yàn)?分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，記錄色譜圖并對(duì)專屬性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷均有良好的專屬性?；旌蠈?duì)照品（含有京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷）和供試品的HPLC。見(jiàn)圖1。

2.2.5?線性關(guān)系考察?取“2.2.2”項(xiàng)下配制的混合對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋2、4、16、32倍。在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別測(cè)定京尼平苷酸峰面積。以京尼平苷酸的質(zhì)量濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。提示京尼平苷酸內(nèi)線性關(guān)系良好。以同樣的方法分別繪制京尼平和松脂醇二葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表2。

2.2.6?中間精密度試驗(yàn)?分別精密吸取京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷的對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得京尼平苷酸、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷峰面積的RSD分別為0.31%，0.38%和0.06%，結(jié)果表明HPLC儀器精密度良好。

2.2.7?供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)?取第2批杜仲極細(xì)粉供試品溶液（批號(hào)：20170422），在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別在配置后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積，計(jì)算得到京尼平苷酸、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷峰面積RSD依次為：1.93%、1.04%、0.21%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8?重復(fù)性試驗(yàn)?精密取6份第2批杜仲極細(xì)粉供試品溶液（批號(hào)：20170422），按上述“2.2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到京尼平苷酸、京尼平、松脂醇二葡萄糖苷峰面積RSD分別為1.71%，1.83%，1.10%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9?回收率試驗(yàn)?取6份第2批杜仲極細(xì)粉供試品（批號(hào)：20170422），精密稱定，置具塞錐形瓶中，一式6份，分別精密加樣京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷的對(duì)照品，按照“2.2.3”項(xiàng)下的方法操作，回流提取1 h，制得供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定得到各有效成分的峰面積，分別計(jì)算它們的回收率，結(jié)果表明京尼平苷酸的平均回收率（n=6）為100.9%，RSD為1.81%;京尼平的平均回收率為98.73%，RSD為0.63%;松脂醇二葡萄糖苷的平均回收率為98.94%，RSD為0.58%。說(shuō)明加樣回收率良好，符合要求。見(jiàn)表3。

2.2.10?杜仲極細(xì)粉飲片與傳統(tǒng)飲片溶出總量的比較?取樣品粉末或傳統(tǒng)飲片，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算含有量。通過(guò)兩樣本間均值t檢驗(yàn)比較同一批杜仲藥材2種不同飲片形式在相同有效成分上的差異，結(jié)果杜仲極細(xì)粉中京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在2.58～3.46 mg/g，0.64～0.74 mg/g和2.67～3.53 mg/g，而杜仲傳統(tǒng)飲片3種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在0.65～1.65 mg/g，0.07～0.23 mg/g和1.63～1.81 mg/g，杜仲極細(xì)粉中3種有效成分含量都顯著高于杜仲傳統(tǒng)飲片（P<0.05）。見(jiàn)表4。

2.3?累積溶出率的測(cè)定

分別取“2.1”項(xiàng)下制備的杜仲傳統(tǒng)飲片和極細(xì)粉各約15 g，精密稱定，投入溶出杯中，按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》（二部）附錄的溶出度漿法測(cè)定法[7]，以已經(jīng)經(jīng)過(guò)10 h超聲脫氣的900 mL蒸餾水為溶劑，漿法，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度（37.0±0.5）℃，分別于5、10、15、30、45、60、80、120、240 min時(shí)各取樣2 mL，在取樣的同時(shí)向溶出杯中補(bǔ)充相同體積和溫度的蒸餾水，再將取出的樣品溶液濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，得到以蒸餾水為溶出介質(zhì)的供試品溶液[8]。以同樣的方法，按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）通則項(xiàng)下制備人工胃液、人工腸液[9]，在進(jìn)行與上述以蒸餾水為溶出介質(zhì)的實(shí)驗(yàn)步驟相同的溶出實(shí)驗(yàn)，最后分別得到了以人工胃液、人工腸液為溶出介質(zhì)的供試品溶液。取“2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)得不同時(shí)間京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷的溶出量。以“2.2.10”項(xiàng)所測(cè)得的各有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積溶出率[累積溶出率=（溶出量/含有量）×100%]。以累積溶出率為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，繪制累積溶出率變化曲線，見(jiàn)圖2。將圖2中不同時(shí)間點(diǎn)各有效成分的累積溶出率數(shù)據(jù)按威布爾分布函數(shù)進(jìn)行處理，擬合參數(shù)，求出溶出度參數(shù)T50、Td[10]。其相應(yīng)的威布爾參數(shù)見(jiàn)表5～7。

2.3.1?以人工胃液為溶出介質(zhì)的杜仲極細(xì)粉和傳統(tǒng)飲片的溶出度比較

2.3.1.1?溶出量的比較?杜仲極細(xì)粉3種有效成分都高于傳統(tǒng)飲片，以240 min為溶出終點(diǎn)，杜仲極細(xì)粉飲片京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷溶出率分別為97%、72%和41%，而杜仲傳統(tǒng)飲片分別為50%、35%和19%，其中，與傳統(tǒng)飲片比較，杜仲極細(xì)粉京尼平苷酸和京尼平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3.1.2?溶出速率的比較?杜仲極細(xì)粉京尼平苷酸溶出速率常數(shù)T0.5和Td分別在4.47～10.37 min和9.21～17.85 min，其傳統(tǒng)飲片京尼平苷酸T0.5和Td分別在68.18～262.02 min和141.31～589.17 min，傳統(tǒng)飲片與極細(xì)粉飲片比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3.2?以人工腸液為溶出介質(zhì)的杜仲極細(xì)粉和傳統(tǒng)飲片的溶出度比較

2.3.2.1?溶出量的比較?以240 min為溶出終點(diǎn)，杜仲極細(xì)粉飲片京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷溶出率分別為90%、75%和94%，而杜仲傳統(tǒng)飲片分別為48%、42%和45%，杜仲極細(xì)粉飲片與傳統(tǒng)飲片比較，3種有效成分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3.2.2?溶出速率的比較?杜仲極細(xì)粉京尼平苷酸、京尼平和松脂醇二葡萄糖苷溶出速率常數(shù)T0.5分別為2.72～10.68 min、4.62～17.41 min和4.25～12.47 min，而傳統(tǒng)飲片3種有效成分T0.5分別為188.94～385.26 min、167.64～529.64 min和202.41～503.47 min，杜仲極細(xì)粉飲片與傳統(tǒng)飲片比較，3種有效成分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明杜仲經(jīng)極細(xì)粉碎后有效成分溶出速率顯著提高，平均在30 min達(dá)到了溶出飽和，相反，傳統(tǒng)飲片組在240 min還未達(dá)到溶出飽和。

2.4?藥動(dòng)學(xué)研究

2.4.1?色譜條件?BEH-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司）;預(yù)柱C18保護(hù)柱（10 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司）;流速為0.3 mL/min，柱溫40 ℃;進(jìn)樣量為2 μL;離子源為ESI源。流動(dòng)相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，95%～95%A;1～1.5 min，95%～13%A;1.5～2.4 min，13%～10%A;2.4～3.0 min，10%～5%A;3～3.5 min，5%～95%A;3.5～4 min，95%～95%A。

2.4.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線制備?取大鼠空白血漿90 μL，分別加入京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL和10 μL內(nèi)參（1 210 ng/mL）制成相當(dāng)于濃度為1、5、10、50、100、500、1 000 ng/mL的血漿樣品，其余按下文“2.4.8”項(xiàng)下血漿樣品的處理方法操作，在“2.4.1”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件下分離測(cè)定，分別以京尼平苷酸溶度為橫坐標(biāo)，京尼平苷酸與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，求得的直線回歸方程Y=0.002 99X+0.031 66（r=0.999 2）

2.4.3?方法專屬性?分別取空白血漿、空白血漿加混合對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)、灌胃給藥后20 min的血漿樣品按“2.4.8”項(xiàng)下血漿樣品的處理方法操作，在“2.4.1”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件下分離測(cè)定，考察方法的專屬性;各成分間在此色譜條件下互不影響，且大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾各組分的測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖4。京尼平苷酸及內(nèi)標(biāo)溶液在此質(zhì)譜色譜條件下互不影響，且大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾京尼平苷酸的測(cè)定。

2.4.4?線性關(guān)系考察?取大鼠空白血漿90 μL，分別加入京尼平苷酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL和10 μL內(nèi)參（1 210 ng/mL）制成相當(dāng)于濃度為1、5、10、50、100、500、1 000 ng/mL的血漿樣品，其余按“2.4.8”項(xiàng)下血漿樣品的處理方法操作，在“2.4.1”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件下分離測(cè)定，分別以京尼平苷酸溶度為橫坐標(biāo)，京尼平苷酸與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，求得的直線回歸方程Y=0.002 99X+0.031 66（r=0.999 2），即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，在1～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1 ng/mL。

2.4.5?精密度試驗(yàn)?取空白血漿90 μL，按“2.4.2”項(xiàng)下操作制成1、50、800 ng/mL 3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄峰面積，計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果顯示，京尼平苷酸的日內(nèi)精密度的RSD分別為5.63%、6.55%、2.55%;準(zhǔn)確度分別為107.06%、102.54%、100.63%;日間精密度的RSD分別為7.23%、4.42%、1.84%;準(zhǔn)確度分別為103.08%、106.42%、101.06%;該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，符合生物樣品分析方法的要求。

2.4.6?穩(wěn)定性試驗(yàn)?按“2.4.2”項(xiàng)下操作配制1、50、800 ng/mL 3個(gè)濃度的QC樣品，每個(gè)濃度3樣本，考察短期穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性，即血漿樣品室溫放置4 h，-20 ℃凍藏30 d和經(jīng)歷3次凍融循環(huán)周期后的穩(wěn)定性。見(jiàn)表9。由表可知，含有京尼平苷酸的血漿樣品在以上條件下，都具有較好的穩(wěn)定性。

2.4.7?提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)?精密吸取京尼平苷酸對(duì)照品溶液10 μL加入90 μL空白血漿，按“2.4.2”項(xiàng)下分別配制成1、50、800 ng/mL 3個(gè)濃度的QC樣品，每一個(gè)濃度進(jìn)行6樣本分析，記錄其峰面積。以提取后的色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣的色譜峰面積之比，考察樣品提取回收率;將提取后的空白血漿樣品加入對(duì)照品溶液所測(cè)得的峰面積與同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的峰面積之比，即為基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示，京尼平苷酸提取回收率的RSD分別為7.29%、5.11%、7.84%;基質(zhì)效應(yīng)分別為3.35%、5.93%、5.27%。該方法提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)良好，符合生物樣品分析方法的要求。

2.4.8?血漿樣品處理?從冰箱取出待測(cè)樣品，充分解凍后渦旋60 s混合均勻。取90 μL的血漿樣品，加10 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋10 s混合均勻。加入甲醇300 μL，渦旋3 min，靜置3 min后，以12 000 r/min離心半徑8.60 cm，轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液200 μL，常溫真空干燥。待樣品揮干后，加入100 μL甲醇，渦旋3 min，以12 000 r/min離心半徑8.60 cm，轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清，取2 μL用于UPLC-MS/MS分析。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)通過(guò)DAS2.0軟件進(jìn)行處理[12]。

2.4.9?給藥方法與血漿采集?杜仲水煎液的制備：取杜仲生品50 g，置于砂鍋之中，精密加入水500 mL，武火煎煮至沸騰，文火煎煮20 min后，煎煮2次，用雙層紗布過(guò)濾后，合并2次煎煮濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至含藥量為0.4 g/mL，即得傳統(tǒng)飲片組灌胃給藥所需的高劑量水煎液，以同樣的方法制備含藥量分別為0.2 g/mL和0.1 g/mL的水煎液，即中劑量與低劑量水煎液，備用。杜仲極細(xì)粉混懸液的制備：精密稱取杜仲極細(xì)粉16 g，放入研缽中，加入0.5%羧甲基纖維素鈉40 mL研磨成混懸液，即得含藥量為0.4 g/mL的高劑量流體，以同樣的方法制備含藥量分別為0.2 g/mL和0.1 g/mL的極細(xì)粉混懸液，備用。雄性的SD大鼠36只，隨機(jī)分為杜仲傳統(tǒng)飲片組和極細(xì)粉組，每組18只，每組又分別分為高、中、低3個(gè)劑量組，每組6只。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，杜仲生藥材的劑量分別為1 000、2 000、4 000 mg/kg（根據(jù)2015版《中華人民共和國(guó)藥典》，杜仲藥材的用量是6～10 g。根據(jù)體表面積換算法，折算成大鼠的用量），按照杜仲提取物2.0 mL/200 g的灌胃劑量進(jìn)行給藥。分別于給藥后10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、150 min、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢采血約0.5 mL，置肝素化試管中，4 000 r/min，離心半徑8.60 cm，離心10 min，分離血漿，-20 ℃冷凍保存，備用。

2.4.10?動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算?血藥濃度-時(shí)間結(jié)果見(jiàn)圖5，并用DAS 2.0藥動(dòng)學(xué)軟件擬合，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表10。由圖5和表10可知，大鼠灌胃給藥后，水煎液3個(gè)劑量組達(dá)峰時(shí)間（Tmax）平均在63 min，而極細(xì)粉由低劑量到高劑量的Tmax分別為75、90、132 min，在相同劑量下，極細(xì)粉組分別是水煎液組的1.15、1.50、2.03倍，說(shuō)明傳統(tǒng)飲片水煎液相較于極細(xì)粉混懸液跟有利于有效成分的吸收，而底、高劑量極細(xì)粉組與相應(yīng)的傳統(tǒng)飲片組的MRT（0-t）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明極細(xì)粉中京尼平苷酸在體內(nèi)消除緩慢。

3?討論

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，杜仲極細(xì)粉2（X2）與杜仲傳統(tǒng)飲片2（C2）京尼平苷酸的溶出總量分別為3.34 mg/g和1.52 mg/g，京尼平的溶出總量分別為0.74 mg/g和0.23 mg/g，松脂醇二葡萄糖苷的溶出總量分別為3.53 mg/g和1.63 mg/g，杜仲極細(xì)粉2（X2）3種有效成分的溶出總量相較于杜仲傳統(tǒng)飲片2（C2）分別增加了54.49%、68.91%和53.82%，表明杜仲傳統(tǒng)飲片經(jīng)超微粉碎成極細(xì)粉后可以顯著提高有效成分的溶出（P<0.05），理論上植物細(xì)胞中的化學(xué)成分可能受細(xì)胞屏障的影響，有效成分不易與提取溶劑接觸，較難溶解完全，而超微粉碎技術(shù)破除了這種障礙，比如，將細(xì)胞屏障之一的杜仲膠微粉化，因而增加了有效成分的溶出[11]。

藥時(shí)曲線的溶出總量上，以240 min為終點(diǎn)，通過(guò)比較同批杜仲藥材同一有效成分在2種不同劑型的溶出行為，發(fā)現(xiàn)3批杜仲極細(xì)粉京尼平苷酸在人工胃液和人工腸液中的溶出總量顯著高于3批傳統(tǒng)飲片（P<0.01），極細(xì)粉組京尼平在3種溶出介質(zhì)中都顯著高于傳統(tǒng)飲片組（P<0.05），且傳統(tǒng)飲片組京尼平在蒸餾水中未檢出，可能是由于苷元極性較低，使其在水中較難溶出;松脂醇二葡萄糖苷在人工腸液和蒸餾水中極細(xì)粉組顯著高于傳統(tǒng)飲片組（P<0.05），而在人工胃液中，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;說(shuō)明杜仲傳統(tǒng)飲片經(jīng)超微粉碎后可以顯著提高有效成分在胃腸道的溶出，從而增強(qiáng)藥效;通過(guò)比較同一種劑型的有效成分在3種溶出介質(zhì)溶出總量，發(fā)現(xiàn)松脂醇二葡萄糖苷在人工腸液中的溶出總量都明顯高于人工胃液和蒸餾水（P<0.05），說(shuō)明腸道可能為松脂醇二葡萄糖苷的主要吸收部位。

根據(jù)溶出曲線和威布爾分布函數(shù)的擬合參數(shù)可知，杜仲極細(xì)粉組有效成分平均在30 min達(dá)到了溶出飽和，達(dá)到了溶出總量的90%，相反，傳統(tǒng)飲片組在240 min還未達(dá)到溶出飽和，只達(dá)到溶出總量的45%，說(shuō)明杜仲極細(xì)粉可以顯著提高有效成分的溶出速率和溶出總量。原因可能是極細(xì)粉碎過(guò)程破壞了杜仲的細(xì)胞壁，藥材比表面積增大，導(dǎo)致其溶出速率增大。表明了杜仲選取極細(xì)粉入藥更有利于有效成分的溶出，從而減少用藥劑量，達(dá)到節(jié)約藥材的目的。

雖然在相同劑量下，杜仲極細(xì)粉組AUC（0-t）與傳統(tǒng)飲片組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），傳統(tǒng)飲片組的Tmax低于相應(yīng)的極細(xì)粉組，但極細(xì)粉高、低劑量組的平均駐留時(shí)間MRT（0-t）與傳統(tǒng)飲片高、低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明杜仲極細(xì)粉碎后減緩了京尼平苷酸在體內(nèi)的消除速率，從而延長(zhǎng)其在體內(nèi)的作用時(shí)間，其原因可能是極細(xì)粉顆粒吸附在胃腸壁上，延長(zhǎng)極細(xì)粉排除體外所需要的時(shí)間[13]，從而有助于藥效的持久發(fā)揮。杜仲極細(xì)粉與傳統(tǒng)飲片比較，生物利用度沒(méi)有提高，原因可能是極細(xì)粉的給藥方式與其正常的用法不同，通常極細(xì)粉用法為熱水沖服，而本實(shí)驗(yàn)給藥方式為羧甲基纖維素鈉混懸液，與熱水比較混懸液中杜仲極細(xì)粉有效成分未在短時(shí)間內(nèi)快速溶出，導(dǎo)致曲線下面積和達(dá)峰時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

細(xì)胞級(jí)粉碎是對(duì)中藥材進(jìn)行超微粉碎的目的，即打破中藥材的細(xì)胞壁，從而減小細(xì)胞內(nèi)的有效成分的溶出阻力，加快一般藥材的浸潤(rùn)、溶脹、滲透和擴(kuò)散[7，9，14]。將中藥材進(jìn)行超微粉碎之后，其粉體的色澤變得均勻，質(zhì)感變得細(xì)膩，顆粒感會(huì)逐漸消失，藥物的有效成分利用度提高，同時(shí)微細(xì)化的中藥物料會(huì)有比較強(qiáng)的溶解性、表面吸附力、分散性和親和力，從而同時(shí)增大了中藥材的溶出量和溶出率，最終有利于藥物的吸收與利用[14-15]。杜仲粉體臨床用藥療效的水平一定程度上受有效成分的溶出度的影響，將其制成極細(xì)粉入藥，提高溶出速率的同時(shí)[16]，也有利于保證杜仲在復(fù)方應(yīng)用中發(fā)揮出最大的療效并減少貴重藥材的用量[17]。

參考文獻(xiàn)

[1]王志宏，彭勝，雷明盛，等.杜仲主要生物活性研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013，25（9）：1302-1309.

[2]鄔曉臣，歐陽(yáng)輝，張近寶，等.杜仲多糖對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2014，37（1）：34-36.

[3]肖芳，覃藝，范潤(rùn)勇，等.杜仲及鹽杜仲飲片的均勻化分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（4）：9-14.

[4]李德成，劉慶燕，韓傳偉.中藥超微粉碎技術(shù)在中藥制劑中廣泛應(yīng)用的優(yōu)越性[J].世界中醫(yī)藥，2010，5（6）：430-431，439.

[5]蔡璐，梁少瑜，戴開(kāi)金，等.人參超微粉與細(xì)粉的體外溶出度比較[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，33（10）：1547-1550.

[6]蔡萍，李躍輝，肖娟，等.鐵包金按摩膏中鐵包金超微粉與飲片質(zhì)量對(duì)比研究[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（11）：1771-1773.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：121-122.

[8]梁兆昌，褚洪標(biāo)，肖琳，等.杜仲超微粉體理化特性及體外溶出性能研究[J].中草藥，2015，46（11）：1609-1614.

[9]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：325-326.

[10]鄒龍，桂卉，周春湘，等.雄黃超微粉體與常規(guī)粉體的體外溶出研究[J].世界中醫(yī)藥，2009，4（1）：53-54.

[11]丁志平，蔡光先，唐正平，等.靈芝的常規(guī)粉與超微粉中多糖溶出度比較實(shí)驗(yàn)[J].湖南中醫(yī)雜志，2010，26（6）：105-107.

[12]高倩倩，翁澤斌，趙根華，等.鹽炙對(duì)杜仲中京尼平苷酸體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31（5）：453-456.

[13]馬玉芳，林雪玲，俞道進(jìn)，等.黃連解毒散超微粉有效成分小檗堿在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（3）：875-879.

[14]閆丹，江敏瑜，張傳輝，等.基于多成分測(cè)定的血竭三七接骨膏中粉體粒徑與溶出度的相關(guān)性研究[J].中草藥，2017，48（21）：4432-4439.

[15]李德成，劉慶燕，韓傳偉.中藥超微粉碎技術(shù)在中藥制劑中廣泛應(yīng)用的優(yōu)越性[J].世界中醫(yī)藥，2010，5（6）：430-431，439.

[16]梁緒中，余志銀，孫利國(guó).黃芪破壁飲片研究進(jìn)展[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（8）：2220-2224.

[17]王姍姍，施崇精，劉小妹，等.基于有效成分的溶出性與粉末分散性構(gòu)建通脈大生片的粉末分散體[J].中草藥，2018，49（13）：3017-3025.

（2019-11-02收稿?責(zé)任編輯：王明）