馬紫童 唐秀鳳 高瑩瑩 于萍 王瀚 劉仁慧

摘要?目的：研究大鼠血清氧化調節(jié)因子的增齡性改變及平補陰陽中藥淫羊藿女貞子的影響作用。方法：8個月齡雄性SD大鼠，隨機分為7組，飼養(yǎng)至相應月齡，包括9個月齡組、12個月齡組、15個月齡組、17個月齡組，淫羊藿組、女貞子組、淫羊藿女貞子組（配伍組），以3、6個月齡雄性大鼠為青年對照組。各用藥組飼養(yǎng)至15個月齡后開始灌胃給予相應藥物2個月。取血清檢測以下指標：總抗氧化能力（TT-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、還原型谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）、總一氧化氮合成酶（tNOS）、誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、結構型一氧化氮合酶（cNOS）及8-羥基脫氧鳥苷（8-OHDG）。結果：與青年大鼠比較，17個月齡大鼠血清SOD、GSH、GSH-PX及T-AOC水平顯著降低（均P<0.01），NO、tNOS、iNOS、MDA及8-OHDG含量顯著升高（P<0.05或0.01），cNOS差異無統(tǒng)計學意義。與17個月齡大鼠比較，配伍組SOD、GSH、GSH-PX及T-AOC水平顯著升高（均P<0.01），NO、tNOS、iNOS、cNOS、MDA及8-OHDG含量均顯著降低（P<0.05或0.01）?；诙鄬痈兄∕ulti-Layer Perceptron，MLP）神經(jīng)網(wǎng)絡模型，結果顯示淫羊藿女貞子合用可使17個月齡自然衰老大鼠的上述指標的改變逆轉至（10.45±0.87）個月，作用優(yōu)于淫羊藿、女貞子單用。結論：淫羊藿女貞子配伍延緩衰老的作用與其改善衰老大鼠血清自由基損傷有關。

關鍵詞?自然衰老;淫羊藿/女貞子;自由基損傷;抗氧化作用

Abstract?Objective：To study the influence and action of serum oxidation regulating factors in rats and the effects of compatibility of Herba Epimedii and Fructus Ligustrilucidi，which are for even reinforcing-reducing yin and yang.Methods：Male SD rats aged 8 months were randomly divided into 7 groups raised to corresponding months，including 9-month group，12-month group，15-month group，17-month group，Herba Epimedii group，F(xiàn)ructus Ligustrilucidi group，and Herba Epimedii and Fructus Ligustrilucidi compatibility group.3-month and 6-month male rats were used as the youth control group.Each medication group was raised to 15 months of age and started to gavage the corresponding drugs for 2 months.Take serum to test the following indicators：total antioxidant capacity（TT-AOC），Superoxide dismutase（SOD），Malondialdehyde（MDA），glutathion peroxidase（GSH-PX），glutathione（GSH），nitric oxide（NO），total nitric oxide synthase（tNOS），inducible nitric oxide synthase（iNOS），constructive nitric oxide synthase（cNOS），8-hydroxy-2′-deoxyguanosine（8-OHDG）.Results：Compared with the youth mice，the levels of SOD，GSH，GSH-PX and T-AOC were decreased significantly（all P<0.01）in 17 months mice serum，and the contents of NO，tNOS，iNOS，MDA and 8-OHDG were increased significantly（P<0.05 or 0.01），cNOS difference was not statistically significant.Compared with 17 months group，the levels of SOD，GSH，GSH-PX and T-AOC were decreased significantly in the compatibility group.The contents of NO，tNOS，iNOS，MDA，cNOS and 8-OHDG were decreased significantly（all P<0.01）.Based on the study of multi-layer neural network（MLP）model，it was confirmed that the compatibility group could reverse the above-mentioned changes to（10.45±0.87）months old，and the effect was better than that of Fructus Ligustrilucidi and Herba Hpimedii alone.Conclusion：The compatibility of Herba Epimedii and Ligustrum Lucidum can delay senescence.It may be related to the improvement of free radical injury in aging rats.

Keywords?Natural aging; Herba Hpimedii/Fructus Ligustrilucidi; Free radical injury; Antioxidation

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.010

隨著社會的發(fā)展、醫(yī)學的進步，人類平均壽命不斷增高，老齡化已成為嚴重的社會問題[1]。如何延緩衰老，改善老年人生命質量成為世界各國學者的研究重點。衰老自由基學說（Free Radical Theory of Aging，F(xiàn)RTA）是現(xiàn)代醫(yī)學認識衰老發(fā)病機制的重要學說之一，認為在代謝過程中通過許多相互關聯(lián)的反應產(chǎn)生自由基，其可導致DNA、蛋白質和脂質的損傷及積累，進而導致疾病的發(fā)生和機體的衰老[2]。中醫(yī)學在延緩衰老方面有著豐富的理論與實踐經(jīng)驗，從《黃帝內經(jīng)》起中醫(yī)學就建立并發(fā)展起了各種的衰老學說，其中臟腑虛衰學說尤其是腎虛，腎中陰陽不足占領主導地位[3]，故補腎是延緩衰老的主要治法。具有平補腎中陰陽、補腎填精之功的淫羊藿、女貞子藥對源于國家級名老中醫(yī)李世增教授50余年臨床經(jīng)驗篩選，臨床常用于治療衰老相關疾病[4]。前期實驗研究證實，淫羊藿女貞子配伍對衰老相關疾病骨質疏松以及慢性肺部疾病哮喘均有顯著療效[5]。本研究基于上述認識，選擇檢測自然衰老大鼠血清中相關氧化調節(jié)因子的含量為研究切入點，并采用不同月齡自然生長大鼠模型建立神經(jīng)網(wǎng)絡模型，探討中藥淫羊藿女貞子單用及配伍對血清氧自由基損傷的影響。現(xiàn)報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?SPF級健康雄性SD大鼠，3個月齡（8只）、6個月齡組（8只）、8個月齡（56只）由北京維通利華實驗動物技術股份有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2016-0001，動物倫理號：AEEI-2016-178。大鼠置于SPF級動物房內飼養(yǎng)，室溫（23±2）℃，濕度為50%±5%，照明晝夜明暗交替時間為12 h/12 h，自由飲水、進食。

1.1.2?藥物?中藥材酒女貞子（北京盛世龍藥業(yè)有限公司，批號：1709025）;中藥材炙淫羊藿（北京人衛(wèi)中藥飲片廠，批號：17082301）。

1.1.3?試劑與儀器?谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathion Peroxidase，GSH-PX）測定試劑盒（貨號：A005）、微量還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）測定試劑盒（貨號：A006-2）、一氧化氮合成酶（NOS）分型測試盒（Total Antioxidant Capacity，tNOS;Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS;Constructive Nitric Oxide Synthase;cNOS）（貨號：A014-1-1）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）測定試劑盒（貨號：A013-2）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（貨號：A003-1）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）測定試劑盒（貨號：A001-3）、總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）檢測試劑盒（貨號：A015-1）均購于中國南京建成生物工程研究所;8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHDG）酶免試劑盒（BLUE GENE公司，貨號：E02H0007）;三用電熱恒溫水箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：SHHW21.420AⅡ）、高速組織勻漿機（IKA公司，德國，型號：T10）、多功能基因蛋白檢測儀（Molecular Devices公司，美國，型號：SpectraMax i3D）。

1.2?方法

1.2.1?分組方法?8個月齡大鼠56只隨機分為7組，包括9個月齡組、12個月齡組、15個月齡組、17個月齡組、淫羊藿女貞子組（配伍組）、淫羊藿組、女貞子組，每組8只。SPF級3個月齡（8只）、6個月齡（8只）作為青年對照組。

1.2.2?給藥方法?3、6、9、12、15個月齡組不給予藥物治療。17個月齡組與用藥各組正常飼養(yǎng)至15個月齡后開始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥2個月。17個月齡組、淫羊藿組、女貞子組、配伍組分別給予飲用水5 mL/kg、淫羊藿煎劑2 g/kg、女貞子煎劑1.5 g/kg、淫羊藿女貞子（4∶3）煎劑3.5 g/kg（相當于臨床等效劑量）體質量灌胃。

1.2.3?取材及檢測?3、6個月齡組大鼠購買后適應環(huán)境1周后處死;9、12、15個月齡組飼養(yǎng)至相應月齡后處死;其他組飼養(yǎng)至17個月齡后處死。禁食16 h后，腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心取血清。采用比色法檢測大鼠血清tNOS、iNOS、cNOS、GSH-PX、T-AOC;微板法檢測GSH、NO;WST-1法檢測SOD;TBA法檢測MDA;酶免法檢測血清8-OHDG水平。以上檢測均按照測試盒說明書進行。

1.3?統(tǒng)計學方法?采用SPSS 18.0 for Windows對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗結果選擇LSD（方差齊）或Tamhane′s T2（方差不齊），綜合分析采用神經(jīng)網(wǎng)絡分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結果

2.1?大鼠血清中T-AOC、GSH-PX及GSH水平的增齡性改變及淫羊藿女貞子的影響?大鼠血清T-AOC、GSH-PX及GSH值分別在9、3、6個月齡處達到峰值，之后隨著月齡的增加而逐漸降低。與17個月齡組大鼠比較，淫羊藿、女貞子單用及配伍組血清T-AOC、GSH含量均顯著升高（P<0.01或P<0.05）;淫羊藿及配伍組血清GSH-PX活力顯著升高。見表1、表2。

2.2?大鼠血清中NO和NOS的增齡性改變及淫羊藿女貞子的影響?不同月齡組大鼠血清NO、tNOS及iNOS值隨著月齡的增加而出現(xiàn)逐漸增加的趨勢，cNOS值無增齡性改變。與17個月齡組比較，各給藥組大鼠血清中NO、tNOS、iNOS的含量均顯著減少（P<0.01或P<0.05）;女貞子組及配伍組大鼠血清cNOS含量均顯著減少（P<0.01或P<0.05）。配伍組大鼠對血清NO影響與女貞子組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），對tNOS的影響與淫羊藿、女貞子組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）。見表3、表4。

2.3?大鼠血清SOD、MDA、8-OHDG的增齡性改變及淫羊藿女貞子的影響?不同年齡組大鼠血清SOD含量隨著月齡的增加而逐漸降低;而MDA和8-OHDG含量出現(xiàn)逐漸升高的趨勢。與17個月齡組比較，淫羊藿、女貞子單用及配伍均能顯著升高血清SOD水平，降低血清MDA及8-OHDG水平。此外配伍組對血清SOD的影響與女貞子組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），對MDA的影響較淫羊藿、女貞子單用組差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表5、表6。

2.4?基于神經(jīng)網(wǎng)絡模型評價淫羊藿女貞子延緩衰老的綜合影響作用?對6個不同月齡組的10項檢測指標應用MLP神經(jīng)網(wǎng)絡分析，其中訓練樣本33個，測試樣本15個，保持樣本5個，得到神經(jīng)網(wǎng)絡模型包括輸入層神經(jīng)元個數(shù)10個，隱藏層神經(jīng)元個數(shù)5個，輸出層神經(jīng)元個數(shù)6個，得到的模型訓練樣本百分比錯誤預測1.3%，測試樣本百分比錯誤預測3.2%。利用此模型對給藥各組樣本的10項數(shù)據(jù)進行預測，與17個月齡組的預測值（16.87±0.23）個月比較，得到配伍組預測月齡為（10.45±0.87）個月、淫羊藿組預測月齡為（12.79±0.84）個月、女貞子組預測月齡為（13.73±1.15）個月均顯著降低（均P<0.01）。與淫羊藿、女貞子單用比較，配伍組預測月齡顯著性降低（均P<0.01）。根據(jù)輸入生理指標對網(wǎng)絡的影響程度。見圖1?？芍狦SH-PX，SOD、T-AOC、tNOS、NO、iNOS、GSH均是本神經(jīng)網(wǎng)絡模型中較為重要的影響因素（標準化的重要性>50%）。見表7，圖1。

3?討論

衰老是指機體發(fā)育至成熟以后，隨著年齡增長，機體的結構形態(tài)、生理功能等出現(xiàn)一系列退行性變化[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學對衰老機制已經(jīng)形成多種學說，其中自由基學說是最具代表性的衰老學說之一。這種理論認為：機體內許多物質代謝中產(chǎn)生過氧化的自由基，自由基反應活躍且易引發(fā)連鎖反應，導致機體損傷，如引起脂質過氧化、形成脂褐素、損傷蛋白質使之變性、破壞細胞膜導致細胞死亡等[7]?；钚匝酰≧eactive Oxygen Species，ROS）具有不成對電子，稱為自由基，生物體內主要有超氧陰離子、羥基、NO等。ROS作為穩(wěn)態(tài)代償反應的激活劑，隨著年齡的增長而增加，以通過或各種防御機制刺激細胞增殖來維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。然而，從一定的限度開始，ROS作為刺激因子加重機體的衰老相關的損傷[8]。ROS的濃度是由ROS的生產(chǎn)速率與各種抗氧化化合物和酶的清除速率之間的平衡決定的，血管系統(tǒng)中具有抗氧化酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)是主要的防御活性氧對機體的損害[9-10]。SOD，過氧化氫酶（CAT），GSH-PX是該系統(tǒng)重要的抗氧化酶，可以清除體內自由基。GSH含有一個活潑的巰基-SH，能夠與自由基結合，而發(fā)揮抗氧化能力。MDA是脂質過氧化的重要產(chǎn)物，是衡量體內自由基代謝的指標之一，MDA的積累過多，可導致細胞、組織、器官的損傷。

在哺乳動物中，ROS主要來源是線粒體呼吸、細胞色素P450、NADPH氧化酶、NO合成酶等。NO是體內重要的信使分子和神經(jīng)遞質，參與神經(jīng)遞質傳遞、血壓調節(jié)、免疫及炎性反應等，高濃度的NO可發(fā)揮毒性作用，破壞線粒體正常功能，引起細胞凋亡[11]。NOS是NO合成過程中唯一的限速酶，其活性可直接影響NO的生成量與其生物學效應。NOS分為神經(jīng)型NOS、內皮型NOS和iNOS。其中前二者可統(tǒng)稱為結構型NOS（cNOS）[12-13]。cNOS活性受細胞內鈣濃度的調控，而iNOS可通過細胞因子、脂多糖和其他免疫相關因子的刺激誘導表達[14]。ROS過量產(chǎn)生可阻礙核和線粒體DNA修復，并氧化損傷DNA產(chǎn)生8-OHDG，造成細胞功能改變，最終引起組織器官功能減退[15]。因此8-OHDG可作為氧化損傷標記物，代表細胞氧化損害嚴重程度。

陰陽失調說認為陰陽之間的變化是一切事物運動變化的根據(jù)，同時也是生命生長、發(fā)育、衰老以至死亡的根本原因?！端貑枴り庩枒蟠笳摗吩疲骸澳苤邠p八益，則二者可調，不知用此，則早衰之節(jié)也”，明確指出人的衰老同陰陽虛衰而導致的陰陽失調有關[16]。然而隨著年齡增加，腎陰、腎陽虧虛的逐漸加重，出現(xiàn)陰陽的偏盛偏衰或陰陽兩衰，這是導致衰老的重要因素。淫羊藿、女貞子是常用的延緩衰老的補腎中藥，二者配伍可平補腎中陰陽，是國家級名老中醫(yī)李世增教授常用于治療衰老相關疾病的基本藥對組合。

本研究通過檢測自然衰老大鼠血清中SOD、GSH、GSH-PX、T-AOC、NO、tNOS、iNOS、cNOS、MDA及8-OHDG含量，觀察大鼠血清內抗氧化能力。結果顯示，17個月齡老年大鼠較青年大鼠（3、6個月齡）血清中SOD、T-AOC、GSH-PX及GSH水平顯著降低，NO、tNOS、iNOS、MDA及8-OHDG含量顯著升高，提示17個月齡大鼠抗氧化能力下調，體內自由基累積，與文獻研究的衰老模型抗氧化能力減弱一致。用藥各組對不同指標的作用不等。淫羊藿、女貞子單用及配伍均可提高衰老大鼠血清T-AOC、SOD和GSH水平，并降低NO、tNOS、iNOS、MDA、8-OHDG水平;淫羊藿單用和配伍組能顯著升高血清GSH-PX水平。基于神經(jīng)網(wǎng)絡模型綜合評價了淫羊藿、女貞子單用及配伍的作用，評價淫羊藿、女貞子單用及配伍對衰老大鼠血清上述與自由基損傷相關10個指標的綜合作用，與17個月齡衰老大鼠比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;且配伍組的作用優(yōu)于2藥的單用，證實了配伍用藥的優(yōu)越性及合理性。

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（2019-09-21收稿?責任編輯：王楊）