孫玲云，原 翔，劉怡文，孔金玉，蘭子君，孫 蔚，張秀森，郭藝博，高社干

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，中國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，其死亡率名列中國十大惡性腫瘤的第四位[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生和發(fā)展有關，被認為是食管鱗癌的高危因素[2]。有研究表明，Pg可利用膜運輸途徑進入細胞，從而實現(xiàn)其在宿主細胞內的長期存活[3]。

細胞膜運輸途徑包括一系列高度動態(tài)的內吞作用、分泌和自噬途徑，這些過程需要不同SNAREs、GTPases以及肌動蛋白細胞骨架的聯(lián)合作用，它們對于維持細胞器的穩(wěn)態(tài)和定位以及確保細胞內運輸至關重要。細胞內病原體，比如細菌和病毒，必須穿過宿主細胞膜才能進入細胞，為了避免被溶酶體降解，它們隱藏在固有免疫傳感器中，會建立一個安全的生態(tài)位以便于自身的生存和復制，但最終為了離開宿主細胞，不得不再次穿過細胞膜。因此，這些病原體已經(jīng)進化出不同的方式來操縱和利用宿主細胞膜運輸途徑。實際上，最近對200株革蘭氏陰性菌分泌的獨立因子進行的篩選顯示，這些獨立因子中有30%以上分泌到宿主細胞膜上[4]。在它們穿越細胞膜的整個過程中，不同的病原體使用不同的策略，這取決于他們對生存和復制的要求以及他們與宿主共同進化的方式。例如，某些細菌駐留并劫持內吞途徑以供復制，而其他細菌則避免內吞途徑，并在其他地方建立其細胞內生態(tài)位[5]。除了使用宿主細胞膜或膜區(qū)室，病毒可以利用宿主細胞機制(比如翻譯機制)，供自己復制[6]。然而，操縱宿主細胞膜最關鍵的接觸點在不同的病原體之間非常相似：細胞膜、肌動蛋白細胞骨架、內吞途徑、分泌途徑和自噬[5-7]。一些新技術，如全基因組CRISPR/Cas9篩選和Cryo-EM，有力地提升了對病原體與宿主細胞膜相互作用的認識。本文討論細胞內細菌和病毒在靶向膜運輸后利用細胞分泌和自噬途徑方面的最新進展。

1 病原體操縱自噬途徑

自噬途徑可能類似于細胞內病原體最具威脅性的膜運輸途徑，因為它可以被宿主細胞用于吞噬和降解入侵者。因此，大多數(shù)病原體避免與吞噬體或自噬途徑的成分融合。但是，某些病原體已經(jīng)形成利用這種抗菌途徑的策略。

Pg作為一種牙周致病菌，能夠利用其引發(fā)的細胞自噬實現(xiàn)其在宿主細胞內的生存和增殖，從而逃避宿主的免疫監(jiān)視。Pg的菌毛通過與整合素蛋白α5β1相結合實現(xiàn)其對細胞的黏附，是Pg內化于宿主細胞的初始步驟。研究表明，自噬抑制劑渥曼青霉素能顯著減少牙齦上皮細胞中Pg的數(shù)目，表明自噬可能有助于胞內Pg的存活。

Pg已顯示出可以刺激內皮細胞自噬并利用自噬途徑發(fā)揮其優(yōu)勢。在人冠狀動脈內皮細胞中，Pg位于自噬體中。細胞內攝取后，Pg從早期自噬體過渡到晚期自噬體，并阻止了自溶酶體的形成，通過延遲自噬體—溶酶體融合或重定向正常自噬運輸。此外，由于觀察到自噬小體標記物LC3-Ⅱ與Pg共定位，還發(fā)現(xiàn)Pg可刺激人主動脈內皮細胞中的自噬。Pg向自噬途徑的運輸似乎取決于宿主細胞類型。Pg通過顛覆宿主自噬途徑的而存活，這是逃避先天免疫系統(tǒng)并持續(xù)存在于宿主體內的一種細菌策略[3]。

2 病原體抑制自噬途徑

Pg在牙齦上皮細胞中可能存在3種運輸途徑，即自噬、溶酶體及再循環(huán)途徑。吞噬細胞中溶酶體的成熟需要自噬蛋白LC3與黑素曲菌素(melanoregulin，MREG)相結合，因而MREG介導的LC3依賴性的降解途徑是清除細菌的必要過程，Blasi等[8]在重度牙周炎患者的牙齦上皮細胞中觀察到自噬蛋白LC3與黑素曲菌素的重新分布，二者呈現(xiàn)一定程度的共定位，而在輕度牙周炎及健康人群中分離的牙齦上皮細胞中則觀察不到這一現(xiàn)象。定量分析顯示健康人牙齦上皮細胞中的LC3Ⅱ水平高于牙周炎患者，同時牙周炎患者的MREG與Beclin水平降低至基線水平的50%，因而推測牙周炎患者牙齦上皮細胞中的Pg感染可能影響了MREG和(或)LC3的表達，抑制了正常的自噬過程，導致Pg在胞內的清除減少，從而引起慢性牙周炎。

嗜肺軍團菌(Legionellapsneumophila,Lp) 是避免自噬的病原體之一，它使用幾種細菌獨立因子來關閉這條通路。獨立因子RavZ具有半胱氨酸蛋白酶活性，不可逆轉地切割磷脂酰乙醇胺和LC3之間的酰胺鍵，在此期間，LC3失去其末端甘氨酸[9]。因此，RavZ處理的LC3的細胞池不能再重新脂質化，導致對自噬的強烈抑制。目前尚不清楚RavZ是如何識別LC3的，以及它如何從自噬體膜中提取LC3。目前的模型是RavZ擁有一個C端PI3P結合結構域，它允許被募集到自噬體膜[10]，并且擁有一個N端LC3相互作用區(qū)域(LC3-interacting region,LIR)基序，該基序與自噬體表面上PE錨定的LC3結合[11]。另一種抑制自噬的機制是獨立因子LPG1137對宿主SNARE蛋白Stx17的切割[12]。這導致PtIns3P在線粒體相關膜上的丟失，從而導致自噬的消失。為了使自己免受免疫細胞的自噬降解，細胞內細菌用其外膜蛋白OmpB保護自己不被自噬機制識別[13]。OmpB既在細菌周圍形成保護層，又阻止其他細菌外膜蛋白的泛素化，從而使細菌逃避自噬受體的識別。在對腸道沙門氏菌、血清傷寒沙門氏菌逃避自噬的研究中發(fā)現(xiàn)，液泡型H+轉運(V)-ATP酶是這種抗菌宿主防御途徑中的一種新的參與者[14-15]。研究表明，鼠傷寒沙門氏菌獨立因子SopF，是維持含沙門氏菌液泡所需的一種磷酸肌醇結合蛋白[16]，ADP-核糖核酸是v-ATP酶的一個亞基，它阻止招募ATG16L1到鼠傷寒沙門氏菌，并阻止傷寒桿菌被自噬清除[14]。

3 病原體破壞自噬途徑

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)產(chǎn)生致孔毒素李斯特菌溶蛋白O(listeriolysin O，LLO)，它是感染周期中不同步驟的關鍵毒力因子。最近研究LLO的細胞內功能時，發(fā)現(xiàn)了一種新的線粒體吞噬降解受體[17]。LLO誘導Nod樣受體X1(Nod-like receptor X1，NLRX1)的寡聚，后者暴露了NLRX1上的LIR基序，從而促進其與LC3的結合和誘導線粒體吞噬。通過減少線粒體活性氧的產(chǎn)生，對單核細胞增生癥有保護作用。黃病毒為了其自身的復制，劫持了選擇性自噬途徑。病毒蛋白酶NS3切割ERphagy受體FAM134B，從而抑制ERphagy，促進病毒的產(chǎn)生[18]。在脂滴上，DENV蛋白NS4A與宿主蛋白AUP1結合。這種相互作用激活了AUP1的乙酰轉移酶活性，從而促進脂肪吞噬以支持病毒顆粒的產(chǎn)生[19]。腸道病毒D68(EV-D68)為了自身的利益而主動誘導自噬。病毒復制需要自噬體SNARESNAP29和SNARESNAP47。但是，后來在感染期間，EV-D68蛋白酶C3通過切割SNAP29抑制自噬體—溶酶體融合[20]。自噬對人巨細胞病毒也具有上述的功能，并且似乎對病毒粒子的有效組裝很重要[21-22]。最近的一份報告提示LC3同源物在病毒顆粒中的摻入，表明人類巨細胞病毒使用自噬膜來使自身成熟[22]。

4 病原體操縱分泌途徑

分泌通路對宿主細胞的蛋白質、脂質的代謝和穩(wěn)態(tài)起著至關重要的作用，因此是細胞內病原體的一個有吸引力的靶點。分泌途徑中的膜轉運是由ARF和Rab家族的特殊小GTPase、融合因子(例如可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體和膜形成蛋白)調節(jié)的，其中許多蛋白質被不同的細胞內病原體(包括細菌、病毒、寄生蟲和真菌)靶向和/或利用。本文重點介紹最近發(fā)現(xiàn)的微生物利用宿主細胞分泌途徑的一些例子。

4.1 嗜肺軍團菌

Lp是分泌途徑的主要操縱者之一。一旦進入宿主細胞，Lp通過其第 Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)分泌前所未有數(shù)量(>330)的細菌效應蛋白[23]。許多這些獨立因子通過翻譯后修飾(post-translational modifications，PTMS)(如磷酸化、泛素化和甲基化)調節(jié)幾種宿主蛋白的功能，并且導致了新PTMS(比如磷酸膽堿)或者新的生化機制(如非規(guī)范性蛋白泛素化)的產(chǎn)生[24-27]。一旦感染，一小部分獨立因子阻止吞噬體與內小體/溶酶體系統(tǒng)的融合，而其他獨立因子則有助于建立和重塑嗜肺軍團菌的細胞內生態(tài)位、質膜衍生的含有軍團菌的液泡(Legionella-containing vacuole，LCV)。這些獨立因子與內質網(wǎng)衍生膜建立接觸，并將LCV轉化為嗜肺軍團菌復制所需的內質網(wǎng)樣細胞器。LCV似乎首先與管狀內質網(wǎng)、內質網(wǎng)片段和內質網(wǎng)衍生的小泡相互作用，隨后在其表面獲得粗糙的內質網(wǎng)標記和核糖體，但事件的確切順序尚不完全清楚[28-29]。

在這方面研究得最充分的宿主細胞因子是Rab1，它是一個參與內質網(wǎng)到高爾基體轉運的小的GTP酶，在感染的不同階段被多個Lp獨立因子靶向并修飾，以將內質網(wǎng)衍生的囊泡募集到LCV[24-30]。先前的工作表明，Rab1的活性受獨立因子介導的AMP化(和去AMP化)調節(jié)和磷酸膽堿(和去磷酸膽堿)的開關區(qū)域的調節(jié)[24-30]。除了AMPylating Rab1，獨立因子DrrA可以招募外囊成分Sec5、Sec6和Sec15到LCV，介導其與內質網(wǎng)衍生囊泡的融合[31]。獨立因子SETA可以葡聚糖化Rab1的開關結構域，以抑制其功能[32]。

Rab1是SidE效應家族(Sid Es)的一個靶標，Rab1在LCV形成中起著關鍵作用[25-33]。Sid Es揭示了蛋白質泛素化的一種新的、非規(guī)范的機制，是目前研究的主要焦點。與典型的泛素化(需要E1-配體、E2-連接酶、E3-配體和ATP的協(xié)同作用)相比，SidEs是“多合一”泛素連接酶，它首先用NAD衍生的ADP-核糖修飾泛素，并隨后轉移磷?；?phosphoribosyl，PR)-泛素到目標蛋白的絲氨酸殘基上[25-26，33-35]。Sid Es的活性被獨立因子Sid J所抵消，該獨立因子Sid J通過其單ADP核糖基轉移酶結構域的多谷氨酸化抑制Sid Es[36-39]。最初，Sid Es主要針對小型GTPases，如RAB1、RAB6(高爾基體內運輸)、RAB33b(高爾基體內運輸)和RAB30(高爾基體基礎設施的維護、自噬體的生物發(fā)生)[25]。隨后的一項后續(xù)研究確定了內質—微管形成蛋白，即網(wǎng)狀蛋白4(RTN4)是SIDE介導的PR泛素化的附加底物[28]。用PR-UBS修飾RTN4似乎誘導了它的寡聚，并誘導了在LCV周圍具有突起的假小泡的形成。最近的兩項獨立研究最終表明，PR-Ub可以被獨立因子DupA和DupB移除，并使用互補的方法確定了數(shù)百個潛在的SidEs靶標[29-40]。其中的靶點是與ER重塑和ER-phagy有關的蛋白質(如LNP1、RTN1、RTN3、FAM134A-C、SEC62和TEX264)，表明這些過程對于LCV生物發(fā)生具有重要作用。

Sid Es的活性導致內質網(wǎng)片段化和修飾的內質網(wǎng)蛋白在LCV周圍積累，這表明內質網(wǎng)片段化可能是Lp將內質網(wǎng)膜招募到LCV的另一種機制[29-40]。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，大的、具有內質網(wǎng)整形功能的、在內質網(wǎng)駐留的GTPaseatlastin3(ATL3)[41]，可以促進管狀內質網(wǎng)招募LCV，并介導內質網(wǎng)衍生膜在LCV周圍的同型融合[42]。在進行的全基因組宿主細胞CRISPR篩選中發(fā)現(xiàn)RAB10和RABIF是將管狀內質網(wǎng)招募到LCV所需的附加的宿主細胞因子[43]。English AR等發(fā)現(xiàn)由RabIF穩(wěn)定的Rab10被Lp獨立因子SidC/SDCA招募到LCV，并被尚未確定的獨立因子泛素化。敲除RAB10和RABIF抑制了RTN4與LCV的共定位。RAB10能誘導囊泡狀、動態(tài)內質網(wǎng)結構域的內質網(wǎng)小管的生長[44]。這些結構是否與先前在LCV周圍觀察到的RTN4陽性假囊泡相同尚待確定[28]。因此，LCV似乎通過幾種獨立的機制—包括通過修飾小的GTPase和ER片段INDU從ERES中招募內質網(wǎng)衍生的囊泡、由SIDE介導的PR泛素化的ER形成蛋白。因此，LCV似乎通過幾種獨立的機制獲得內質網(wǎng)膜，包括通過修飾小的GTPase和ER片段、從ERES中招募內質網(wǎng)衍生的囊泡、由SidE介導的內質網(wǎng)形成蛋白的PR泛素化。

4.2 黃病毒

黃病毒屬的成員，包括登革熱病毒(DengueVirus，DENV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、西尼羅河病毒(WestNilevirus，WNV)和黃熱病病毒，與分泌途徑，特別是與內質網(wǎng)有密切的聯(lián)系[45]。這些病毒的基因組由正鏈RNA([+]RNA)組成，主要模仿宿主細胞mRNA。該RNA在宿主細胞核糖體上以帽依賴的方式翻譯[46]，并在粗糙的內質網(wǎng)膜上合成單個多肽，然后將其切割成3種結構蛋白(structural proteins，SPs)和7種非結構蛋白(nonstructural protein，NSPs)，其中跨膜多通道蛋白，由病毒和宿主蛋白酶組成[45]。

最近的高通量篩選顯示了fom9的核心作用。用于病毒復制或成熟的poiu3rER宿主細胞蛋白或蛋白質復合物，如轉運蛋白組分SEC61、寡核苷酸轉移酶復合物或蛋白質復合物在內質網(wǎng)相關降解中溶解[47-49]。內質網(wǎng)膜復合物的組分為DENV和ZIKV復制的必需宿主細胞因子，并且促進必需病毒NSP、NS4A和NS4B的折疊和穩(wěn)定性，這是它們有效的生物合成所必需的[50-52]。為了保護新形成的病毒顆粒和復制復合物免受宿主細胞胞漿和天然免疫檢測的影響，NSP戲劇性地重塑了內質網(wǎng)，從而創(chuàng)建了一個由粗糙的內質網(wǎng)中內陷的囊泡包(vesicles packets，VPs)和光滑內質網(wǎng)中的卷積膜組成的互聯(lián)網(wǎng)絡[46]?？拷黇P和宿主細胞線粒體的卷曲膜的功能尚不清楚，它們的形成似乎是細胞型特異性的，但有人認為，這些膜結構對病毒蛋白的成熟起著一定的作用，或者是脂質儲存的部位[46]。相反，VP似乎是復制細胞器，其中病毒RNA被病毒復制復合物復制，然后新合成的(+)RNA轉移到相對的內質網(wǎng)池中的出芽病毒體中。但是，這些膜結構是如何形成的，以及它們的生物發(fā)生需要哪些宿主細胞因子，目前尚不清楚。

最近的研究表明，與Lp相似，DENV和ZIKV利用內質網(wǎng)膜形成蛋白進行復制、細胞內運輸和成熟[53-54]。Atlastins ATL2和ATL3兩個內質網(wǎng)駐留的大GTPase介導ER小管的融合，似乎在VPs的形成和病毒的成熟中起著核心作用[53]。盡管ATL2參與了VP的生物發(fā)生，ATL3在病毒的運輸和成熟中起著重要作用。這兩種蛋白質的相互作用在感染上發(fā)生了巨大的變化[53]。例如，在感染過程中，ADP-核糖基化因子4(ARF4)與ATL3的結合增強，病毒組裝和釋放需要ARF4，并且需要ATL3來回收宿主細胞蛋白酶呋喃到高爾基體，在高爾基體里它切割病毒包膜蛋白PrM，這是病毒成熟的一個重要步驟。內質網(wǎng)小管蛋白和ERphagy受體RTN3，特別是其亞型RTN3.1A，被招募到復制細胞器并且促進病毒復制[54]。敲除RTN3.1A可導致VPs囊泡減少或伸長。

綜上所述，為了在宿主細胞中生存，細胞內病原體制定了不同的策略來避免或顛覆宿主細胞膜的運輸途徑。膜運輸途徑的利用往往是通過修飾或裂解關鍵宿主細胞蛋白來實現(xiàn)的。諸如CRISPR/Cas9篩選之類的新型高通量技術，使得能夠鑒定以前未探索的宿主細胞靶標。例如，最近的進展突顯了參與ER重塑和ERphagy的蛋白質在發(fā)病機制中的新作用。因為對ERphagy的詳細機制仍知之甚少，因此研究針對ERphagy的細胞內病原體可能會為闡明這一途徑提供線索，并有助于識別其關鍵成分。如本文所述，病原體靶向和操縱了其他形式的選擇性自噬，例如線粒體吞噬、脂肪吞噬和異種吞噬，因此一種新的線粒體吞噬受體被發(fā)現(xiàn)。因此，病原體是寶貴的細胞生物學工具，將繼續(xù)幫助我們了解關鍵的細胞膜運輸途徑。

Pg在體外侵襲多種細胞，目前，Pg與細胞膜運輸間關系的研究多集中于牙齦上皮細胞和血管內皮細胞，與食管上皮細胞膜之間是否也存在靶向關系及其中具體的分子機制研究較少，值得進一步研究，為食管疾病的干預治療提供新的思路。