亢愷雯，王 淵，郭新榮，李 杰，馬 雪 ，王 強

[1.陜西中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046；3.陜西省針藥結合重點實驗室，陜西 咸陽 712046 ；4.咸陽市神經(jīng)生物學(針灸)重點實驗室，陜西 咸陽 712046]

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。PD多好發(fā)于中老年人，典型臨床表現(xiàn)主要包括運動遲緩、靜止性震顫、肌強直、姿勢平衡障礙和認知障礙等癥狀。其主要病理學特點為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)細胞選擇性死亡與殘存神經(jīng)細胞出現(xiàn)以α-突觸核蛋白為主要成分的路易小體[2]，導致紋狀體多巴胺合成減少，黑質(zhì)-紋狀體通路多巴胺神經(jīng)支配減弱，膽堿能神經(jīng)功能相對增強，二者之間的平衡被打破，出現(xiàn)上述臨床癥狀。PD的發(fā)病與遺傳、環(huán)境、免疫、氧化應激等多種因素綜合作用有關，其具體的發(fā)病機制尚未明確[1，3]，但神經(jīng)炎癥反應在其中起著至關重要的作用[4]。尸檢結果表明，PD患者腦組織黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞與星型膠質(zhì)細胞被激活，趨化因子及炎癥因子表達增加，加劇了多巴胺神經(jīng)細胞的損傷[5]。慢性神經(jīng)炎癥會導致多巴胺合成減少，PD病程加重，過度的神經(jīng)炎癥反應產(chǎn)生大量炎癥遞質(zhì)，進一步加速多巴胺神經(jīng)細胞損傷。

在眾多炎癥反應因子中，由高遷移率組蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)介導的信號通路備受關注[6]。HMGB1是一種高度保守的非組蛋白DNA結合蛋白，可由炎癥細胞主動分泌或由壞死細胞被動釋放。HMGB1可在炎癥因子刺激下，結合晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor of advanced glycation end products， RAGE)和Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)啟動并放大炎癥免疫反應，是腦組織神經(jīng)免疫炎癥反應中的關鍵環(huán)節(jié)[7-9]。HMGB1可能在PD發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用。

“嗅三針”療法由雙側迎香穴和印堂穴組成，是劉智斌教授通過多年的臨床實踐經(jīng)驗總結并應用于嗅覺障礙及神經(jīng)退行性病變的特色電針療法[10-11]。PD作為典型的神經(jīng)退行性病變，“嗅三針”可明顯改善PD患者嗅覺障礙，延緩病程進展。本實驗通過經(jīng)鼻滴注脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)構建小鼠PD模型，觀察“嗅三針”對PD小鼠學習記憶能力及黑質(zhì)區(qū)HMGB1及核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)蛋白表達的影響，探索“嗅三針”改善PD癥狀，抑制神經(jīng)炎癥因子，延緩病程進展的作用機制。

1 材料

1.1 動物 選取40只清潔級成年健康雄性的C57BL/6小鼠，實驗使用許可證號：SYXK(陜)2018-0001，體質(zhì)量為22～25 g，根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、模型組、左旋多巴組、電針組，每組10只。動物由西安交通大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2020-0001。小鼠清潔級飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～24℃，濕度為40%～70%，12 h明暗交替，自由飲食，適應性喂養(yǎng)1周。對動物的處理遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 試劑 抗HMGB1兔多克隆抗體(ab191583)：英國abcam；抗NF-κB兔多克隆抗體(sc-17984)：Santa Cruz；乙醚(批號 81290101400)：上海展云化工有限公司；芐絲肼(批號BK7293)：美國Invitrogen 公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(批號 SV30010)：美國Abcam公司；LPS(批號 DG-L2890)、左旋多巴(批號 GKT137831)：Sigma公司。

1.3 儀器 勻漿機(i10型)：德國IKN；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)：上海吉量軟件科技有限公司；組織切片機：德國Leica公司；SDZ-Ⅱ型電針儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司。

2 方法

2.1 實驗動物模型復制 采用隨機數(shù)字表法將40只小鼠分為10只空白組，另外30只用于模型復制，采用LPS經(jīng)鼻滴注后分為模型組、電針組、左旋多巴組各10只。PD動物模型制備方法：用氣體乙醚將小鼠麻醉后，暴露小鼠鼻孔，用移液槍將LPS(1 g/L，溶于生理鹽水)緩慢少量滴入小鼠鼻孔內(nèi)，注意動作輕柔，防止小鼠將液體吸入呼吸道，盡量使LPS在鼻腔吸收。空白組滴入等容積的生理鹽水[12]。處理完畢后將小鼠分別放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

2.2 干預方法

2.2.1 “嗅三針”組 小鼠穴位定位：印堂穴于小鼠眼距間向上2 mm處，迎香穴于小鼠鼻腔外側向上被毛分界處。針刺操作：由內(nèi)側向上方向斜刺迎香穴，由指向鼻根方向平刺印堂穴，進針均為0.3 cm。電針參數(shù)設置：強度為1 mA，疏密波(2 Hz/100 Hz)；正極接印堂穴，負極接一側迎香穴，刺激時長10 min；負極換另一側迎香，刺激時長10 min，每日1次。電針干預于模型復制開始后第1天同步進行。共干預10次，5次后休息2 d，共12 d。

2.2.2 左旋多巴組 將左旋多巴(10 mg/kg)和芐絲肼(2.5 mg/kg)溶解于0.9%生理鹽水，配置為左旋多巴注射液，每日定時于腹腔注射0.2 mL，每日1次，共10次，5次后休息2 d，共12 d。

2.2.3 模型組及空白組 模型組僅使用LPS經(jīng)鼻滴注持續(xù)進行模型復制，之后不進行任何干預?？瞻捉M與電針組同步抓取，不進行固定及針刺干預。

2.3 行為學檢測方法 在干預結束后，對各組小鼠進行行為學測試。水迷宮實驗包括定位航行實驗與空間探索實驗。在直徑150 cm的圓形水池中加入溫水(22～26 ℃)，將水池分為4個象限，設置參照物。隨機選取一個象限放置平臺，位于水下2 cm。需進行5 d定位航行試驗，每天定時由同一工作人員將小鼠分別隨機從4 個象限放入水中，將其攀爬至平臺的時間記為潛伏期。在測試中，如果小鼠60 s內(nèi)未找到平臺，工作人員需要幫助其上平臺，隨后停留10 s，記錄其逃避潛伏期為60 s。記錄每次的潛伏期測試值。行為學測試結束后進行心臟灌注取材。

2.4 免疫組織化學法檢測HMGB1表達水平 麻醉小鼠后，用4%多聚甲醛固定腦組織，根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜，切除前囟后，于3～4 mm的冠狀切面，采用腦模具截取黑質(zhì)及紋狀體部分，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，將組織包埋塊切成厚度約5 μm的組織片，撈片后烘干。切片脫蠟、梯度乙醇水化，PBS清洗，滅活過氧化物酶，并煮沸進行抗原修復，PBS清洗后用BSA封閉液封閉，一抗孵育4 ℃過夜，室溫放置30 min，PBS沖洗后滴加二抗孵育，PBS沖洗，滴加SABC，配置DAB溶液顯色反應，水洗，蘇木精染核，梯度脫水后透明中性樹脂封片并觀察。

2.5 Western blot檢測HMGB1、NF-κB蛋白表達水平 取小鼠腦組織加入RIPA裂解液與PMSF[V(RIPA)∶V(PMSF)=100∶1]，在無菌環(huán)境下，冰上研磨30 min，于4 ℃、12 000 r/min條件下離心，15 min后取上清液置于離心管-80 ℃儲存。測定蛋白含量(Bradford法)，分離樣品蛋白，制備分離膠與濃縮膠，根據(jù)蛋白濃度計算上樣量進行蛋白上樣，隨后進行SDS-PAGE電泳1.5 h，在轉模緩沖液中轉移至PVDF膜，將其放置于5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，于4 ℃冰箱分別置于HMGB1、NF-κB及GAPDH一抗中孵育過夜，TBST洗膜5 min，共3次，使用相應二抗避光室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min，共3次，使用化學發(fā)光試劑顯影后，結果用Bio-RAD Quantity one 圖像分析軟件進行掃描，分析HMGB1、NF-κB及內(nèi)參GAPDH的灰度值。

3 結果

3.1 4組小鼠行為學測試結果比較 模型組小鼠抵達終點用時多于空白組(P<0.05)；電針組到達終點時間較模型組明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 4組小鼠行為學測試結果比較

3.2 4組小鼠黑質(zhì)區(qū)HMGB1陽性細胞表達水平比較 與空白組比較，模型組黑質(zhì)中 HMGB1陽性細胞數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，電針組黑質(zhì)中HMGB1陽性細胞數(shù)降低(P<0.05)。見圖1、表2。

注：A.空白組；B.模型組；C.左旋多巴組；D.電針組

表2 4組小鼠黑質(zhì)區(qū)HMGB1陽性細胞數(shù)比較

3.3 4組小鼠黑質(zhì)區(qū)HMGB1、NF-κB蛋白表達水平比較 與空白組比較，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)HMGB1、NF-κB蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，電針組黑質(zhì)中HMGB1表達水平降低(P<0.05)，而NF-κB表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、表3。

4 討論

PD的致病機制復雜，遺傳、年齡、環(huán)境等多種因素交錯影響導致發(fā)病。目前中國人口老齡化趨勢明顯，PD患者逐步增多，其治療多采用多巴胺類藥物替代治療緩解患者運動障礙，而長期服用后存在療效減退，癥狀波動，容易出現(xiàn)并發(fā)癥。因此，深入探究PD發(fā)病的分子機制并尋找新的治療靶點至關重要。

圖2 4組小鼠黑質(zhì)中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白表達水平比較

表3 4組小鼠黑質(zhì)區(qū)HMGB1、NF-κB蛋白表達水平比較

HMGB1作為促炎因子，在炎癥反應晚期作用突出[13-16]。HMGB1在大腦中主要位于神經(jīng)細胞、小膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞[17-18]，主要功能是參與維持核小體結構穩(wěn)定，調(diào)節(jié)基因轉錄、細胞遷移和神經(jīng)細胞生長[19]。在PD患者中，HMGB1主要位于路易小體及路易神經(jīng)細胞突起[20]，是PD病理中的關鍵細胞死亡因素。有研究[21]表明，大鼠的HMGB1可特異性結合α-突觸核蛋白。因此，抑制HMGB1表達是PD的一個新的治療靶點[22]。免疫組織化學及蛋白免疫印跡法檢測結果表明，“嗅三針”干預后，小鼠黑質(zhì)區(qū)HMGB1的表達水平降低。課題組前期研究結果[23]證實了“嗅三針”早期干預對腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6等有抑制作用。結合本次實驗結果，證實“嗅三針”可以抑制HMGB1表達及神經(jīng)炎癥的發(fā)展，起到延緩疾病進程的作用。

有研究[24]表明，在大鼠神經(jīng)細胞及膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)中，HMGB1可以與MAC1作用后結合小膠質(zhì)細胞膜上的受體，并激活NF-κB信號通路，促進還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶氧化酶活化，誘導慢性持續(xù)進展的神經(jīng)炎癥反應及黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)細胞的變性缺失。TLR4作為一種細胞表面識別受體，可識別內(nèi)源性HMGB1，募集髓樣分化因子MyD88樣接頭蛋白，隨后與白細胞介素-1等受體相關激酶家族蛋白形成復合物，最終促使核轉錄因子進入細胞核發(fā)揮調(diào)控作用[25-26]。本研究結果表明，“嗅三針”對于NF-κB p65的表達無明顯作用，故考慮嗅三針的作用機制可能與HMGB1結合RAGE受體誘導的自噬、基因轉錄有關，仍需進一步研究其具體機制。

“嗅三針”是劉智斌教授創(chuàng)立的特色電針療法，多年的臨床實踐發(fā)現(xiàn)該療法對改善早期神經(jīng)退行性疾病的嗅覺障礙療效明確。根據(jù)其“感知一體，嗅腦同治”的思想基礎，嗅覺作為人體重要感覺之一，中樞位于海馬區(qū)，而海馬區(qū)也是機體學習記憶等認知功能的中樞?！靶崛槨蓖ㄟ^興奮嗅覺通路，達到疏通經(jīng)絡、醒智開竅的效果。迎香穴歸屬于手陽明大腸經(jīng)，可治療嗅覺障礙。該穴為手陽明、足陽明經(jīng)交會之穴，交通經(jīng)脈氣血，既可以應用于胃經(jīng)病證，也可用于頭面五官疾病和神志病等。印堂穴屬督脈，“入絡腦”，有醒腦開竅之效，該穴多用于鼻淵、鼻衄、嗅覺障礙等，但也可治療督脈循行遠隔的腦部疾患，如癡呆、癲狂。因此，對于神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，選用此二穴同治。本實驗結果顯示，“嗅三針”的早期干預可抑制PD小鼠HMGB1表達，抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展，緩解PD認知功能障礙，為治療PD提供了理論依據(jù)及治療靶向。