范恒瑞，宋明宇，邱 瑾，吳 迪

(3M中國有限公司，北京 大興 100176)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，本病最易感染的動物包括牛、豬、羊等?？谔阋咴趤喼?、非洲、中東和南美均有流行，發(fā)病率極高，傳播速度極快。世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類人獸共患病首位，要求成員國將口蹄疫列入必須報告動物疾病的名錄中[1]。疫苗接種是特異性預防FMD的有效手段。FMD滅活疫苗由完整病毒經過滅活劑滅活后制成，在預防和控制FMD的過程中發(fā)揮著重要作用[2]。

FMDV本身抗原性較差，病毒滅活后對其抗原的影響較大，所以現階段口蹄疫疫苗生產中，高純度的口蹄疫疫苗能保證單位使用劑量中抗原含量和純度，這顯得尤為重要，也是目前疫苗接種的策略。這對于病毒的下游純化提出了很高的要求。另外，2009年以前，國內滅活口蹄疫疫苗上游多為采用轉瓶貼壁培養(yǎng)方式，隨著對于疫苗需求的提升，該培養(yǎng)方式需大量轉瓶、效率低下、表達量低的弊端逐漸顯現。因此，近年來細胞培養(yǎng)技術由以往的貼壁培養(yǎng)慢慢向懸浮培養(yǎng)轉變，病毒產量得到了顯著提高[3]。然而，隨著病毒產量的提高，培養(yǎng)方式的轉變，給下游純化帶來更大的壓力，因為伴隨培養(yǎng)過程產生的細胞碎片、細胞釋放宿主蛋白、宿主DNA等相應也劇增，這對于下游純化的能力提出了進一步的要求。

膜過濾技術廣泛應用于疫苗等生物制品的生產過程中，其中直流過濾技術通常應用于病毒液的收獲過程，用以分離細胞碎片等不溶性雜質。早期的FMDV澄清主要采用以折疊膜濾芯為代表的表面過濾技術；隨著培養(yǎng)條件的變化，細胞碎片雜質的增多，表面過濾難以達到澄清效果，而且由于表面過濾載量較低，濾材成本也越來越高。在上述背景下，深層過濾在FMDV的胞液分離過程得到越來越多的應用。深層過濾濾材通常由天然來源的長細纖維構成，過濾介質成膜后形成的通道往往都十分曲折，類似迷宮式的孔徑結構。雜質顆粒往往在濾材內部而非表面被截留捕捉。而且，過濾通道壁面往往會以靜電作用或者分子間作用力的方式吸附一部分極其細小的顆粒雜質?？傮w而言，深層過濾的過濾機理表現為機械截留和吸附作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 口蹄疫疫苗細胞培養(yǎng)液BHK21 懸浮培養(yǎng)，經連續(xù)流離心工藝離心上清液。

1.2 主要儀器 2100Q便攜式濁度儀，哈希公司產品；蠕動泵，Cole Parmer公司產品；47 mm過濾夾持器，3M公司產品；Zeta PlusTM深層過濾濾材，型號:60SP、60ZB、30SP、30ZB，3M公司產品。

1.3 恒流過濾方法 安裝深層濾板至恒流過濾裝置，用緩沖液PBS沖洗濾板54 L/m2以上；沖洗完畢后啟動蠕動泵緩慢泵入料液，緩慢調節(jié)泵速至約預計流速，進行料液過濾；記錄過濾過程濾出體積、時間、壓差、濁度。收集濾出液進行抗原檢測。

2 結果

2.1 深層過濾的優(yōu)勢 表面過濾是通過濾材表面對顆粒進行捕捉截留來實現過濾的技術。過濾機理主要是依據流體中顆粒大小進行篩分，大顆粒被截留在濾膜表面。深層過濾利用內部通道，在深度進行顆粒攔截以及吸附[4]。二者對比示意圖如圖1所示。

圖1 深層過濾和表面過濾[5]

取某廠家的口蹄疫疫苗滅活液，分別采用0.45 μm 孔徑的聚丙烯材質表面膜和深層濾板進行預過濾去除細胞碎片，然后再用0.2 μm孔徑的除菌過濾器進行過濾?？蔀V性數據如表1所示。

表1 口蹄疫疫苗細胞培養(yǎng)液深層過濾和表面過濾可濾性測試對比

該口蹄疫疫苗滅活液濁度為77 NTU，如果直接進行除菌過濾，大量細胞碎片勢必造成0.2 μm濾膜很快堵塞，進而影響146S病毒粒子的透過性。因此，在除菌過濾之前設計了預過濾，并且對比了深層過濾和表面過濾這2種預過濾方式。選取雙層深層濾板30ZB+60ZB進行過濾，載量641 L/m2，深層過濾將77 NTU的物料降低至9.65 NTU，澄明透亮；而0.45 μm的表面過濾載量僅僅46 L/m2，濾出液濁度高達41 NTU，不適合作為預過濾。從后續(xù)0.2 μm 除菌過濾的載量對比上可見，深層過濾后除菌濾膜載量為655 L/m2，是對應表面過濾后除菌過濾載量(僅91 L/m2)的7.2倍。

146S檢測結果表明，深層過濾系統收率整體高于表面過濾系統。深層過濾載量是表面過濾的13.9倍，濾出液濁度僅為表面過濾的23.5%，后續(xù)0.2 μm除菌過濾載量是表面過濾的7.2倍。因此，無論從成本角度還是從收率角度考慮，深層過濾系統都明顯優(yōu)于表面膜過濾系統。

2.2 強正電荷深層濾器的優(yōu)勢 針對不同來源的口蹄疫疫苗滅活液，采用正電荷深層濾板和強正電荷深層濾板進行對比測試?？蔀V性結果如表2所示，過濾過程濾速壓差變化如中插彩版圖2所示。

表2 口蹄疫疫苗細胞培養(yǎng)液強正電荷深層過濾可濾性參數

所采用的兩組深層濾板具有一樣的孔徑精度，從載量、壓差變化等角度看，表現非常一致，中插彩版圖2中壓差變化曲線也基本重合。但是從濾出液濁度來看，差異很大。普通正電荷的30SP+60SP雙層濾板的濾出液25 NTU，而同樣孔徑的強正電荷深層濾板30ZB+60ZB雙層濾板的濾出液僅9.65 NTU，僅為普通深層濾板的38.6%。這主要得益于強正電荷深層濾板濾材中特殊的樹脂配基。通過強正電荷雙層濾板，濁度降低至10 NTU以下，細胞碎片被充分吸附或者截留，有利于后續(xù)超濾或者除菌過濾工藝。除了對于不可溶性的細胞碎片有吸附作用，Yigzaw Y等[6]還曾報道過強正電荷深層濾板對于細胞宿主蛋白的去除作用，Dorsey N等[7]報道過強正電荷深層濾板對于DNA的去除作用。

2.3 深層過濾對口蹄疫疫苗上清液的澄清過濾工藝建立 通過上述表面過濾和深層過濾的對比研究、特殊的強正電荷深層濾板澄清效果的研究，針對不同培養(yǎng)條件產生的口蹄疫疫苗滅活上清液，應該給予匹配不同的過濾方案。低濁度、中等濁度、高濁度3種不同濁度的離心上清液，深層過濾方案及相應過濾參數如表3所示。

表3 不同濁度口蹄疫疫苗細胞培養(yǎng)液的過濾方案

對于較低濁度的離心上清，單層深層濾板可以有效澄清，去除少量的細胞碎片；對于中等濁度的離心上清，雙層深層濾板可以有效澄清，尤其是強正電荷的Zeta PlusTMZB系列濾板可以將濁度降低至5 NTU以下；對于較高濁度的離心上清，SP及ZB的組合濾板可以有效澄清。無論哪一種工藝，處理量均在500～800 L/m2，濾出液濁度均低于20 NTU，目標抗原均完全回收，適合規(guī)?；a。

3 討論

20世紀70年代，過濾介質被規(guī)定不得采用石棉材料，因為石棉材料中存在致癌物質。后來，科學家Cuno發(fā)明了Zeta PlusTM濾材，該濾材不含有石棉，但有更強的正電荷。該濾材由木質纖維基體和助濾劑混制而成，生產過程中利用高分子樹脂連接基本成分，其中的正電荷功能基團有效賦予了深層濾材電荷吸附的能力。Hou K等[8]報道了Zeta PlusTM吸附型深層過濾在細小顆粒的捕捉能力上的優(yōu)異表現，如圖3所示。

圖3 深層過濾介質靜電吸附/機械攔截示意圖[4,8]

本試驗選取不同樹脂成分、不同精度的Zeta PlusTM濾材對FMDV培養(yǎng)液進行澄清過濾測試，并與表面過濾進行對比測試。結果顯示，深層過濾相對于表面過濾更加適合于細胞碎片的去除，有利于后續(xù)微生物負荷控制過濾單元(0.2 μm)。另外，通過對比強正電荷深層濾板和普通正電荷深層濾板的過濾效果，強正電荷的Zeta PlusTMZB系列濾板顯示了極強的濁度控制能力，可以將濁度降低至5 NTU 以下，非常有利于提高整個過濾工藝的穩(wěn)健性。

上游培養(yǎng)工藝對于有效成分收獲步驟的影響巨大，本試驗通過測試最終建立了針對不同濁度的細胞培養(yǎng)液的可規(guī)?；倪^濾方案，對于大規(guī)模生產有一定指導意義。