韓金霞，朱亞南，王金文，王吉佳，李 迪，楊靜波

(大慶油田總醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江 大慶 163000)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)指血液內(nèi)脂質(zhì)物未及時排出沉積在動脈內(nèi)膜，久而久之所形成的粥糜樣壞死病灶[1-3]。AS是冠心病、腦梗死及外周血管病的早期征兆和病理基礎(chǔ)，因而有效預(yù)防和治療AS具有重要的臨床意義[4-5]。他汀類藥物，是目前臨床應(yīng)用的有效降脂藥物，主要用于治療高脂血癥。他汀類藥物不僅能強效地降低總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)，而且能一定程度上降低三酰甘油(TG)，還能升高高密度脂蛋白(HDL)，所以被公認為為較全面的調(diào)脂藥[6-7]。同時，對于治療動脈粥樣硬化和預(yù)防冠心病他汀類藥物也能發(fā)揮一定療效[6-7]。辛伐他汀(Simvastatin，Sim)為他汀類藥物，是臨床上治療高脂血癥的一線用藥。Sim作為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，在體內(nèi)主要抑制機體內(nèi)源性膽固醇的合成以及血液中膽固醇的含量[8]。但由于Sim水溶性較差，口服生物利用度有限，因此其臨床應(yīng)用受到一定限制[9]。脂質(zhì)聚合物納米粒(lipid-polymer hybrid nanoparticles, LPNs)，簡稱納米粒，是近幾年研究較熱的一種新型納米給藥系統(tǒng)，與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體和納米粒給藥載體相比，其具有更優(yōu)良的生物相容性，較高的載藥量，生物可降解等優(yōu)勢，是一種極具發(fā)展前景和應(yīng)用前景的一種新型納米給藥載體[10]。本研究通過構(gòu)建辛伐他汀納米粒，主要觀察其對大鼠動脈粥樣硬化的治療效果，并對其作用機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

6～7周齡健康SD大鼠40只，清潔級，雄性，體重180～200 g，采購于北京維通利華實驗動物有限公司提供[SCXK(京)2016-0001]，本研究獲得大慶油田總醫(yī)院倫理委員會批準(20191012)。大鼠以每籠3～4只飼養(yǎng)于排風(fēng)通氣籠具內(nèi)，自由飲水、攝食，飼養(yǎng)場所為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境中[SYXK(黑)2018-007]，動物實驗嚴格按實驗動物3R原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷。

1.1.2 實驗細胞

Caco-2細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，細胞以含20%胎牛血清、1%青-鏈霉素的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2、95%空氣的細胞培養(yǎng)箱中。

1.2 主要試劑與儀器

辛伐他汀(貨號S6196)和COU-6(貨號442631)購自美國Sigma公司；總膽固醇(TC)試劑盒(批號20180105)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號20180917)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號20190106)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號20181224)均購自南京建成生物工程研究所有限公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司；GAPDH抗體購自武漢博士德公司；AMPK抗體、p-AMPK抗體、Acetyl-CoA Carboxylase (ACC)抗體和p-ACC抗體購自美國CST公司。高速剪切機(德國艾卡公司)；電子天平(德國賽多利斯公司)；JEOL JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本日本電子株式會社公司)；高壓均質(zhì)機(德國APV公司)；CX31倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；64R高速低溫離心機(美國Beckman公司)；NanoSight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(英國馬爾文公司)； SpectraMax 190酶標儀(美國美谷分子儀器公司)；AI600凝膠成像儀(美國通用電氣公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 辛伐他丁納米粒的構(gòu)建

制備辛伐他汀納米粒，將10 mg辛伐他汀和50 mg 聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)溶解在10 mL乙腈中作為有機相，磷脂25 mg溶解在0.5 mg無水乙醇中，然后加入到20 mL 60℃預(yù)熱的超純水中分散均勻作為水相。將油相在300 r/min攪拌條件下倒入到水相中，繼續(xù)室溫下攪拌2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈。經(jīng)0.8 μm的濾膜濾過，備用。取制備的辛伐他汀納米粒子，超純水稀釋50倍，取5 μL納米粒溶液滴加到銅網(wǎng)上，自然晾干，透射電鏡下觀察辛伐他汀納米粒的形態(tài)，同時利用納米顆粒分析儀測定其粒徑分布。

1.3.2 納米粒載藥系統(tǒng)細胞攝取研究

香豆素6(COU-6)作為有機熒光染料可模擬細胞對藥物的攝取行為。取對數(shù)期Caco-2細胞接種于兩個13 mm無菌玻璃底細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，次日取制備好的COU-6和COU-6納米粒(COU-6-LPNs)溶液各100 μL加入1.5 mL培養(yǎng)基中混勻備用，取出細胞，PBS洗2遍，各加入配備好的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5 h，后棄去細胞上層液體，用PBS輕柔洗細胞3遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍，加入浸沒細胞量的DAPI 熒光染料(10 μg/mL)染色20 min，PBS洗3遍，封片，鋁箔紙避光4℃保存。熒光顯微鏡拍照，記錄熒光強度。

1.3.3 動脈粥樣硬化模型構(gòu)建、分組及給藥

構(gòu)建動脈粥樣硬化大鼠模型，設(shè)立模型組(Model)、辛伐他汀組(Sim)、辛伐他汀納米粒組(Sim-LPNs)和對照組(Control)。Model組、Sim組和Sim-LPNs組大鼠腹腔注射60萬IU/kg維生素D3，后以高脂飼料飼養(yǎng)8周建立動脈粥樣硬化模型；Control組腹腔注射等體積生理鹽水，以正常飼料飼養(yǎng)8周。造模完成后Control組和Model組每天灌胃給予生理鹽水，Sim組給予Sim 8 mg/(kg·d)， Sim-LPNs組給與Sim-LPNs 8 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥3周。

1.3.4 大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測

給藥最后1 d，動物禁食過夜，各組大鼠以異氟烷持續(xù)麻醉，開腹后于腹主動脈取血約3 mL，室溫下靜置至凝固， 3000 r/min離心10 min，上清液即為血清，將血清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，參照TC、TG、LDL-C、HDL-C檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.3.5 HE染色和動脈粥樣硬化斑塊面積統(tǒng)計

取血后迅速處死大鼠，并進行解剖，取出肝樣本，將樣本左中葉剪下，置入10%甲醛溶液中固定。組織樣本在固定18 h后，流水沖洗12 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟浸泡，包埋，制成4 mm石蠟切片。經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇復(fù)水后，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，梯度乙醇脫水，二甲苯脫乙醇，最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化并拍照。采用Photoshop(軟件)計算動脈粥樣硬化斑塊面積。

1.3.6 蛋白印記實驗檢測肝組織p-AMPK和p-ACC蛋白表達變化

解剖各組大鼠，各取肝組織0.5 g左右，眼科剪剪碎后置于管中，加入1 mL細胞組織裂解液，均質(zhì)儀研碎并于冰上靜置5 min，參考文獻[1]方法提取蛋白，按每孔30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉。按需求加入AMPK抗體(1∶2000)、p-AMPK抗體(1∶500)、ACC抗體(1∶2000)、p-ACC抗體(1∶1000)或GAPDH抗體(1∶5000)4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后加入相應(yīng)的抗兔IgG-HRP二抗(1∶2000)，室溫孵育1 h，PVDF膜以ECL發(fā)光試劑盒進行顯色并于AI600凝膠成像儀中成像，對蛋白印跡條帶進行處理和分析。磷酸化蛋白相對蛋白表達量= 磷酸化蛋白灰度值/(總蛋白灰度值/GAPDH灰度值)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Sim-LPNs的體外表征

Sim-LPNs粒徑分布如圖1A所示， Sim-LPNs的平均動力學(xué)直徑為(180±23) nm。如圖1B所示，在透射電鏡下，Sim-LPNs形態(tài)較為圓整，外觀呈均一的球形。

圖1 辛伐他汀納米粒徑分布和透射電鏡圖Figure 1 The size distribution and transmission electron micrograph of S-LPNs

2.2 納米粒載藥系統(tǒng)細胞攝取水平

COU-6為綠色熒光染料，如圖2所示，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，COU-6和COU-6-LPNs處理后的Caco-2細胞均可發(fā)出綠色熒光，但與COU-6相比，COU-6-LPNs呈現(xiàn)高熒光水平。結(jié)果如圖3所示， COU-6和COU-6-LPNs細胞的平均熒光強度值分別為(221.3±34.5)和(756.8±78.4)，后者熒光強度顯著增強(P<0.01)。

2.3 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

檢測各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，結(jié)果顯示，與對照組(Control)相比，模型組(Model)大鼠TC、TG、LDL-C均顯著升高，HDL-C明顯降低(P<0.01)；相較于Model，辛伐他汀組(Sim)TG和HDL-C變化不明顯，TC和LDL-C顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與Model相比，辛伐他汀納米粒組(Sim-LPNs)TC、TG、LDL-C均顯著降低，HDL-C明顯升高(P<0.01)；與Sim相比，Sim-LPNs大鼠TC和LDL-C顯著降低(P<0.01)(見表1)。

2.4 各組大鼠主動脈HE染色和粥樣硬化斑塊面積

如圖4所示，HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Model組大鼠動脈血管壁粘膜變性和水腫，在血管壁中出現(xiàn)典型的動脈粥樣硬化斑塊，并且脂質(zhì)核心較厚，泡沫明顯；Sim組出現(xiàn)一定改善，但Sim-LPNs組改善更為明顯。計算各組斑塊面積，結(jié)果如表2所示，與Control組相比，Model組動脈血管壁相對斑塊面積和相對斑塊面積/總面均顯著增加(P<0.01)；Control組和Sim組未見明顯差異；Sim-LPNs組相較于Model組動脈血管壁相對斑塊面積和相對斑塊面積/總面明顯減小(P<0.01)。

2.5 各組大鼠肝組織中p-AMPK和p-ACC蛋白表達變化

Western blot結(jié)果顯示，相較于Control組，Model組大鼠肝組織p-AMPK和p-ACC蛋白表達均顯著下調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，Sim組p-AMPK蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)，Sim-LPNs組p-AMPK和p-ACC蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；與Sim組相比，Sim-LPNs組p-AMPK蛋白表達上調(diào)更明顯(P<0.01)，見表3和圖5。

注：A：Caco-2細對COU-6的攝??；B：Caco-2細對COU-6-LPNs的攝取。圖2 Caco-2細對COU-6和COU-6-LPNs的攝取Note. A, Caco-2 fine intake of COU-6. B, Caco-2 fine intake of COU-6-LPNs.Figure 2 Absorption capacity of Caco-2 to COU-6 and COU-6-LPNs

圖3 Caco-2細攝取COU-6和COU-6-LPNs后的 熒光強度Figure 3 Fluorescence intensity of Caco-2 after fine uptake of COU-6 and COU-6-LPNs

3 討論

LPNs作為近幾年大家比較關(guān)注的新型給藥系統(tǒng)，兼具傳統(tǒng)脂質(zhì)體和聚合物納米粒兩種納米藥物載體的優(yōu)點，在增加水不溶性藥物生物利用度和控制藥物釋放等方面顯示出了獨特的優(yōu)勢[11]。PLGA是一種生物可降解的材料、磷脂層為納米載體的外殼，對于疏水性藥物有更好的包載，而磷脂層外殼與細胞膜的表面具有類似的生理功能，因此可增加納米粒子的生物相容性，同時也能夠減緩藥物的釋放[12-14]。此外，納米粒子表面也可以進行功能基團的修飾，可進一步促進細胞的攝取，增強藥效[15-16]。

本研究制備辛伐他汀納米粒，驗證發(fā)現(xiàn)其形態(tài)圓整，外觀呈均一的球形，更有利于增加對生物膜的穿透性及增強細胞內(nèi)的藥效發(fā)揮。本研究發(fā)現(xiàn)LPNs可增強Caco-2細胞對COU-6的攝取。研究顯示，Caco-2細胞可形成與小腸上皮細胞相同的細胞極性和致密的單細胞層結(jié)構(gòu)，分化出絨毛面A和基底面B，可做為研究藥物吸收和轉(zhuǎn)運的有效工具[17-18]。提示，LPNs能提高藥物的小腸吸收。觀察血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平發(fā)現(xiàn)，實驗終點時，Sim可顯著降低TC和 LDL-C水平；而Sim-LPNs不僅可更為顯著的降低TC和 LDL-C水平，還能顯著降低TG水平和升高HDL-C水平。提示，LPNs可

表1 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平Table 1 Serum TC, TG, LDL-C, HDL-C levels of rats in each group

圖4 各組主動脈HE染色Figure 4 HE staining of aorta in each group

表2 各組大鼠動脈血管壁相對斑塊面積

表3 各組大鼠肝組織中p-AMPK和p-ACC相對 蛋白表達量Table 3 Relative protein expression of p-AMPK and p-ACC in liver tissues of rats in each group

圖5 各組大鼠肝組織中p-AMPK和p-ACC蛋白表達水平Figure 5 Expression levels of p-AMPK and p-ACC protein in liver tissues of rats in each group

增強Sim的降脂效果。觀察各組大鼠主動脈粥樣硬化程度發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠動脈血管壁粘膜變性和水腫，在血管壁中出現(xiàn)典型的動脈粥樣硬化斑塊，并且脂質(zhì)核心較厚，泡沫明顯。Sim治療后病理變化得到一定改善，而Sim-LPNs治療后的改善效果更為明顯。計算各組粥樣硬化斑塊面積發(fā)現(xiàn)， Sim-LPNs治療后模型大鼠動脈血管壁相對斑塊面積和相對斑塊面積/總面均明顯減小。這些提示，LPNs可顯著增強Sim對大鼠動脈粥樣硬化的治療效果。

業(yè)已證明，AMPK-ACC信號通路在參與機體能量代謝和脂肪合成中發(fā)揮重要生理作用。文獻報道，AMPK可通過直接磷酸化脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶類，從而改變脂質(zhì)的代謝方向。ACC是AMPK的下游靶點之一，由于ACC是脂肪酸代謝的限速酶，當機體處于應(yīng)激狀態(tài)時，組織細胞內(nèi)AMPK被激活，而活化的AMPK可磷酸化ACC 的79 位點蘇氨酸位點而使后者失活[19-20]。ACC失活后，脂肪酸氧化加劇，血清游離脂肪酸水平降低，脂肪在組織中的沉積減少[19-21]。肝是人體重要的代謝器官，參與糖類、脂類和蛋白質(zhì)的代謝。本研究觀察了肝AMPK和ACC蛋白表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化模型大鼠AMPK和ACC磷酸化蛋白均顯著下調(diào)，Sim治療后模型大鼠肝p-AMPK明顯上調(diào)，但ACC變化不明顯。而Sim-LPNs治療后模型大鼠肝p-AMPK和p-ACC均顯著上調(diào)。這些提示，相較于Sim，Sim-LPNs可明顯激活肝細胞AMPK-ACC信號通路，從而參與促進脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)。

綜上所述，相較于Sim，Sim-LPNs對動脈粥樣硬化大鼠具有較好的治療作用，而該作用可能與增強小腸對藥物的吸收和激活肝細胞AMPK-ACC信號通路增強脂質(zhì)代謝有關(guān)。