韓麗芳，張彩云，劉 瑩，邵繼平，謝學(xué)立，符 健

（海南醫(yī)學(xué)院海南省藥物臨床前藥理毒理學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571199）

鈣調(diào)蛋白磷酸酶B亞基（calcineurin subunit B，CNB）是鈣調(diào)蛋白磷酸酶的調(diào)節(jié)亞基，能促進(jìn)CNA的活性，且相對分子質(zhì)量為19 000，性質(zhì)穩(wěn)定，其經(jīng)典的功能是調(diào)節(jié)鈣調(diào)蛋白磷酸酶的催化活性［1］。此外，CNB還有其單獨(dú)的功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，重組人CNB（recombinant human CNB，rhCNB）在體內(nèi)外對肝癌和胃癌具有良好治療效果，且具有高效低毒的特性。rhCNB作為一個基因工程新型藥物國內(nèi)外市場均無類似產(chǎn)品問世，已經(jīng)作為一個基因工程抗癌新藥進(jìn)行開發(fā)［2-4］，并獲得了中國和美國專利［5-6］。

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）由于特異性強(qiáng)、靈敏度高而廣泛用于蛋白多肽類生物制品的藥動學(xué)研究［7-8］。rhCNB作為我國自主研發(fā)的國家生物制品1類新型抗腫瘤生物藥［9-10］，目前缺少大鼠給藥后的藥動學(xué)和組織分布研究。本研究采用ELISA對大鼠iv給予rhCNB后血藥濃度經(jīng)時變化和組織分布進(jìn)行研究，以闡明rhCNB在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程和組織分布學(xué)特征，為評價rhCNB用于肝癌和胃癌治療的臨床療效提供行之有效的檢測手段，并為設(shè)計(jì)和優(yōu)化臨床試驗(yàn)給藥方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

Wistar大鼠124只，SPF級，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)有限公司提供（動物使用許可證號：SYXK（瓊）2016-0013），雌雄各半，體質(zhì)量242～346 g，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院藥物安評中心動物房。注射用rhCNB（批號：20160910，規(guī)格：每瓶10 mg），海口奇力制藥股份有限公司。rhCNB測定ELISA試劑盒（批號：A217020223），南京金斯瑞公司。TECAN酶標(biāo)儀，奧地利TECAN有限公司；Centrifuge 5810低速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘麓離心機(jī)儀器有限公司；FJ200高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模具廠。

1.2 ELISA測定rhCNB濃度

將含rhCNB樣品和對照品加入96孔板內(nèi)，室溫孵育1 h，洗板4次；加生物素標(biāo)記的抗rhCNB單克隆抗體，孵育1 h，洗板4次；再加入辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉親和素，孵育10 min，洗板4次。加入四甲基聯(lián)苯胺底物，避光室溫孵育5～15 min，最后加終止液（硫酸0.5 mol·L-1）終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度［11］。按上述方法對處理后的樣品進(jìn)行分析，將測得數(shù)據(jù)帶入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出血藥濃度。

1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.1 選擇性［12］

選擇10只未給藥大鼠的組織勻漿液，向其加入定量下限和定量上限水平的分析物來考察選擇性，同時測定未加入分析物的組織勻漿液中rhCNB的含量。

1.3.2 線性范圍

取未給藥大鼠肺和胃組織勻漿液分別加入rhCNB對照品，配制成濃度為0，1，2，4，8，12和16 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按1.2檢測。

1.3.3 準(zhǔn)確度和精密度

取未給藥大鼠肺和胃組織勻漿液分別加入rhCNB標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備成0，1，2，4，8，12和16 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，2，6和12 μg·L-1濃度質(zhì)控樣品（每濃度5平行樣）及定量下限樣品分別作為一個分析批，按1.2檢測。連續(xù)測定3 d，考察1，2，6和12 μg·L-14種濃度肺和胃組織勻漿樣品日內(nèi)準(zhǔn)確度、日間準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度和日間精密度。

1.3.4 回收率

取大鼠肺和胃組織空白勻漿液加入rhCNB對照品配制成20和1000 μg·L-1組織樣品各5份，分別用1×稀釋液稀釋5和100倍后（終濃度為4和10 μg·L-1），按1.2檢測。將測定結(jié)果與理論值比較，計(jì)算回收率（平均實(shí)測值/理論值×100%）。

1.3.5 穩(wěn)定性

取大鼠肺和胃組織空白勻漿液加入rhCNB對照品配制成4，100和1000 μg·L-1組織樣品各3份，分別在室溫（25℃）置2 h、2～8℃置24 h和-20℃置1，4和8周，分別用1×稀釋液稀釋1，10和100倍后，按1.2檢測，考察樣本的穩(wěn)定性。

1.4 給藥和樣品處理

取大鼠72只隨機(jī)分為3組，每組24只，雌雄各半。大鼠iv劑量參考注射用rhCNB的藥效學(xué)劑量，選擇5，10和20 mg·kg-1作為單次給藥劑量，分別于給藥前及給藥后 0.033，0.25，0.5，1，2，4，8和12 h采血；按20 mg·kg-1劑量每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d進(jìn)行多次給藥實(shí)驗(yàn)，第4，5，6和7次給藥前釆血用于谷濃度的測定，分別于末次給藥后0.033，0.25，0.5，1，2，4，6，8和12 h采血。每次從大鼠眼眶靜脈取血0.3 mL，置于肝素化離心管中，1500×g離心20 min，分離血漿，-20℃冰箱保存，按1.2測定rhCNB濃度。測定時用大鼠空白血漿將血漿樣品按不同稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋。

取大鼠32只隨機(jī)分為4組，每組8只，雌雄各半。按10 mg·kg-1劑量給大鼠靜脈注射rhCNB，給藥前取空白血漿，給藥后0.25，1，2和8 h取血處死，立即解剖，采集腦、心、肝、脾、肺、腎、全胃、睪丸、卵巢、體脂、骨骼肌和胸腺等組織。采集的各組織用生理鹽水洗凈表面浮血，濾紙吸干，稱重，置-20℃冷凍保存。測定前，將樣品剪碎后置于高速勻漿器中，加入1×稀釋液在冰浴中制成組織勻漿（心組織稀釋倍數(shù)為1∶40，體脂0.25，1和2 h點(diǎn)稀釋倍數(shù)為1∶30，肝、脾、肺和腎組織稀釋倍數(shù)為1∶20，腦、全胃、睪丸、卵巢、體脂8 h點(diǎn)、骨骼肌和胸腺組織稀釋倍數(shù)為1∶10），充分渦旋混勻，離心（4℃，2000×g離心10 min），取上清液，按1.2測定rhCNB濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得血藥濃度數(shù)據(jù)用DAS3.0軟件釆用非房室模型計(jì)算主要藥動學(xué)參數(shù)。藥動學(xué)參數(shù)使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對單次和多次給藥所得的藥動學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 選擇性

對采集的12個組織進(jìn)行選擇性考察結(jié)果表明，12個組織定量上限≥80%的樣品回收準(zhǔn)確度在±20%范圍內(nèi)，定量下限≥80%的樣品回收準(zhǔn)確度在±25%范圍內(nèi)，且未加入分析物的組織空白勻漿液的測量值均低于定量下限，符合驗(yàn)證的要求。

2.1.2 線性范圍

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸收值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。肺組織直線回歸方程為Y=19.1002X-0.1399，r=0.9987；胃組織直線回歸方程為Y=31.5272X-0.2127，r=0.9917。表明肺和胃組織中rhCNB檢測濃度的范圍為1～16μg·L-1。

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度

肺和胃組織勻漿樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度均符合生物樣品測定要求（表1），肺組織準(zhǔn)確度在-22.5%～14.8%，胃組織準(zhǔn)確度在-20.8%～25.0%之間，符合生物樣品測定要求。

2.1.4 回收率

rhCNB在肺和胃組織中4和10 μg·L-1的回收率均在80%～110%范圍內(nèi)（表2），符合生物樣品測定要求。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

肺和胃組織勻漿中rhCNB濃度在不同條件下均無顯著變化（表3），表明組織樣品在上述條件下穩(wěn)定。

2.2 藥-時曲線

多次給藥組大鼠第4，5，6和7次給藥前采血用ELISA測定谷濃度，結(jié)果均低于檢測下限。

大鼠單次iv給予不同劑量rhCNB及多次給予rhCNB后，用ELISA檢測血藥濃度，得到大鼠體內(nèi)藥-時曲線（圖1）。

2.3 藥動學(xué)參數(shù)

rhCNB 5，10和20 mg·kg-1劑量組消除半衰期（t1/2）分別為0.95，0.85和0.91 h，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異，提示rhCNB在體內(nèi)是恒比消除，消除較快，呈一級動力學(xué)消除過程。

Tab.1 Precision of recombinant human calcineurin B subunit（rhCNB）in lung and stomach tissue of rats

Tab.2 Recovery of rhCNB in lung and stomach tissue of rats

Tab.3 Stability of rhCNB in lung and stomach tissue of rats

rhCNB 5，10和20 mg·kg-1劑量組給藥劑量比為1∶2∶4，AUC0-12h比值為1.0∶1.5∶3.7，藥時曲線下面積與給藥劑量成比例增加，表明在5～20 mg·kg-1劑量范圍內(nèi)，rhCNB在大鼠體內(nèi)基本呈現(xiàn)線性動力學(xué)特征。

多次給藥的主要藥動學(xué)參數(shù)Cmax和AUC0-12h與單次給藥比較無顯著性差異，末次給藥后AUC0-12h積累系數(shù)為0.63，提示rhCNB在大鼠體內(nèi)無明顯蓄積（表4）。

2.4 體內(nèi)組織分布

SD大鼠尾靜脈注射給予注射用rhCNB，給藥0.25，1，2和8 h后麻醉腹主動脈采血，取組織，采用ELISA檢測各個組織或器官內(nèi)rhCNB濃度，得到12個組織或器官內(nèi)rhCNB濃度（圖2）。通過計(jì)算不同組織藥物濃度或血漿藥物濃度比，可看出不同組織中rhCNB的濃度分布由高到低的順序?yàn)轶w脂＞肺＞腎＞脾＞睪丸/卵巢＞心＞肝＞胸腺＞胃＞腦＞骨骼肌。給藥8 h后除腎有較高的濃度外，其他組織或器官的rhCNB含量均較低，說明rhCNB在SD大鼠體內(nèi)無蓄積。

Tab.4 Pharmacokinetic parameters of rhCNB in rats after iv administration

Fig.2 Tissue dynamic distribution of rhCNB in rats after iv administration.After administration of rhCNB，tissue samples were collected at 0.25，1，2 and 8 h.The samples were measured by ELISA.±s，n=8（n=4，ovary and testicle）.

3 討論

ELISA是生物技術(shù)藥物藥動學(xué)研究中最常用的免疫分析方法。用ELISA作為檢測rhCNB在大鼠血藥濃度的方法已經(jīng)進(jìn)行驗(yàn)證，其專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性等均符合驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)［13］。本研究采用ELISA檢測rhCNB在大鼠組織樣本中濃度進(jìn)行方法學(xué)評價結(jié)果表明，各組織中內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾rhCNB的測定，方法選擇性好；在1～16 μg·L-1的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；3個質(zhì)控濃度的日內(nèi)和日間精密度均＜15.0%，有良好的精密度；回收率在80%～110%范圍內(nèi)。表明該方法選擇性、線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、回收率和穩(wěn)定性等均符合驗(yàn)證可接受標(biāo)準(zhǔn)，能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地對組織樣品中的rhCNB進(jìn)行定量檢測。

單次給藥rhCNB 5，10和20 mg·kg-1劑量組rhCNBt1/2分別為0.95，0.85和0.91 h，3個劑量組接近，提示rhCNB在大鼠體內(nèi)消除較快，呈一級動力學(xué)恒比消除，線性動力學(xué)特征。rhCNB在體內(nèi)t1/2約1.0 h，與注射用重組人白細(xì)胞介素2（t1/2為85 min）相似，臨床上通過靜脈點(diǎn)滴延遲給藥時間來維持臨床治療作用［14］。

多次給予rhCNB 20 mg·kg-1后，rhCNBCmax和AUC0-12h均較首次給藥后降低，表明多次給藥后藥物暴露量降低，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠體內(nèi)有rhCNB抗體產(chǎn)生（待發(fā)表），考慮多次給藥后血藥濃度下降可能是由于一方面體內(nèi)抗體的產(chǎn)生導(dǎo)致rhCNB在體內(nèi)的消除增加，另一方面體內(nèi)rhCNB抗體影響了ELISA檢測結(jié)果造成的。因大鼠與人之間存在種屬差異，這種差異決定了人用重組蛋白與實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)的同源蛋白存在不同程度的序列和構(gòu)象差異，大鼠體內(nèi)多次給藥后出現(xiàn)暴露量降低，而在人體內(nèi)是否會出現(xiàn)此現(xiàn)象還需進(jìn)一步驗(yàn)證［15］。組織分布結(jié)果顯示，大鼠靜脈給予rhCNB后，在12個組織中均可測得，rhCNB在體脂、肺、腎、脾等組織的分布較高，在腦、胃、肌肉和胸腺的分布較低。給藥8 h后僅腎有較高的濃度，表明rhCNB是部分經(jīng)腎小球?yàn)V過進(jìn)行消除。

綜上所述，本研究為rhCNB在體內(nèi)藥動學(xué)和組織分布研究提供了可靠的定量檢測方法，闡明了rhCNB單次和多次給藥在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征，為臨床試驗(yàn)給藥方案提供參考。