劉芳林 路影 李飛飛 劉濤 (阜陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 婦科，安徽 阜陽(yáng) 3605；病理科)

宮頸癌是世界第四大最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，而在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國(guó)家，宮頸癌的發(fā)病率與死亡率更高〔1〕。在我國(guó)宮頸癌發(fā)病位居女性惡性腫瘤第二位，且還在逐年攀升，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與年齡相關(guān)，65歲以上患者占宮頸癌死亡患者的40%以上〔2，3〕。人乳頭瘤病毒(HPV)是與宮頸癌高度相關(guān)的病原體，其感染是宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素〔4〕。特別是高風(fēng)險(xiǎn)HPV的基因型(16、18、30和31)與導(dǎo)致癌前病變和癌變的上皮細(xì)胞改變直接相關(guān)〔5〕。宮頸分泌物涂片檢查是一種簡(jiǎn)便非侵入性HPV篩查方法，現(xiàn)在已和薄層液基層細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)(TCT)一起作為婦科常規(guī)檢查技術(shù)〔6〕。目前關(guān)于宮頸分泌物HPV基因型與老年宮頸癌患者癌前病變的關(guān)系的研究仍很局限。本研究旨在評(píng)估宮頸分泌物檢測(cè)高危型HPV基因型對(duì)宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的篩查效果。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2017年2月1日至2019年2月29日在阜陽(yáng)市第二人民醫(yī)院婦科行門(mén)診陰道鏡的65歲以上患者110例，均接受宮頸細(xì)胞學(xué)涂片及HPV基因型檢測(cè)。平均年齡(71.6±6.1)歲，平均體重指數(shù)(BMI)(22.7±3.8)kg/m2。排除既往宮頸癌病史、已接受全子宮切除術(shù)、精神疾病史者。所有患者簽署知情同意書(shū)并報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2宮頸細(xì)胞涂片檢查 置入陰道窺器完全暴露宮頸包括宮頸外口和鱗狀及柱狀上皮交界處。使用細(xì)胞刮刀在子宮頸上單向旋轉(zhuǎn)360°，再將細(xì)胞刷置于宮頸內(nèi)并單向旋轉(zhuǎn)180°。將宮頸分泌物樣品涂在載玻片上，并用噴霧固定劑固定。然后將樣品送到病理科進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果包括意義不明的非典型細(xì)胞(ASCUS)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)或高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)的患者進(jìn)一步接受陰道鏡檢查和陰道鏡引導(dǎo)病理活檢〔7〕。

1.3HPV基因型檢測(cè) 首先使用AmpliLute液體培養(yǎng)基提取及HPV linear array分型試劑盒(購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)從宮頸分泌物中提取DNA。提取的DNA立即保存在-20℃環(huán)境下。然后使用正向(5′-ACACAA CTGTGTTCACTAGC-3′)和反向(5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′)引物對(duì)β-珠蛋白基因的268個(gè)堿基對(duì)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增評(píng)估DNA樣品的完整性。并使用正向(5′-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3′)和反向(5′-AAAAAT AAACTGTAAATCATATTC-3′)引物對(duì)β-珠蛋白陽(yáng)性樣品HPV L1開(kāi)放閱讀框的450個(gè)堿基對(duì)片段繼續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每次反應(yīng)均包括HPV陽(yáng)性和HPV陰性對(duì)照。最后在含溴化乙錠(0.5 mg/ml)的2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物〔8〕。HPV linear array用于對(duì)HPV進(jìn)行基因分型，可分為與宮頸癌高度相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和82，HR-HPV )和與其他低風(fēng)險(xiǎn)型(LR-HPV)〔9〕。

1.4統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS22.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1基線資料 患者宮頸涂片HSIL、LSIL、ASCUS及炎性細(xì)胞比例分別為13例(11.8%)、14例(12.7%)、20例(18.2%)、63例(57.3%)；HPV分型高危型、低危型及陰性比例分別為36例(32.7%)、21例(19.1%)、53例(48.2%)，其中高危型及低危型為本研究對(duì)象，納入后續(xù)研究；共47例接受了病理活檢，包括HPV高危型及低危型43例，其中CIN 3、CIN 2、CIN 1及慢性炎癥比例分別為25.5%、21.3%、12.8%、40.4%及HPV陰性4例(不計(jì)入后續(xù)研究)。

2.2HR-HPV及LR-HPV組臨床資料比較 兩組年齡、BMI及宮頸涂片結(jié)果均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，HR-HPV組高級(jí)別CIN(CIN 2+CIN 3)患者比例高于LR-HPV組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3HPV分型對(duì)病理活檢CIN的診斷價(jià)值 HPV分型對(duì)診斷CIN的靈敏度、特異度、符合率、kappa值及正確指數(shù)分別為82.1%、92.7%、90.0%、74.0%、0.75；HPV分型對(duì)診斷高級(jí)別CIN的靈敏度、特異度、符合率、kappa值及正確指數(shù)分別為81.8%、87.5%、86.4%、61.9%、0.69。

2.4HPV分型與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)并聯(lián)試驗(yàn)對(duì)病理活檢CIN的診斷價(jià)值 并聯(lián)試驗(yàn)對(duì)診斷CIN的靈敏度、特異度、符合率、kappa值及正確指數(shù)分別為100.0%、76.8%、82.7%、62.8%、0.77；對(duì)診斷高級(jí)別CIN分別為100.0%、77.3%、77.3%、50.2%、0.72。見(jiàn)表1。

表1 HR-HPV與LR-HPV組臨床資料比較〔n(%)〕

3 討 論

全球83%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，2015年我國(guó)有近10萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例與3萬(wàn)死亡病例〔10〕。早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療是降低發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵。宮頸癌的發(fā)展是一個(gè)漸進(jìn)過(guò)程，需要10年以上才能從不典型增生發(fā)展成浸潤(rùn)性宮頸癌，老年患者無(wú)論宮頸癌或其癌前病變的患病率及其進(jìn)展速度都要高于年輕患者〔11，12〕。HPV持續(xù)感染是宮頸癌最重要的危險(xiǎn)因素，高危型HPV與宮頸癌密切相關(guān)，老年婦女的HPV感染率也高于年輕婦女〔13,14〕，因此對(duì)HPV進(jìn)行分型對(duì)于老年宮頸癌的預(yù)防有重大意義。根據(jù)2010年進(jìn)行的一項(xiàng)全球回顧性橫斷面研究，浸潤(rùn)性宮頸癌HPV基因型前8位分別是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52和HPV58〔15〕。本研究總HPV感染率為51.8%，最常見(jiàn)的基因型為HPV16、HPV18和HPV58。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查也是宮頸癌篩查的主要手段，細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性患者應(yīng)接受陰道鏡檢查〔16〕，本研究結(jié)果顯示對(duì)HPV基因分型由此指導(dǎo)患者病理活檢的重要性與日俱增。

在病理活檢CIN 2級(jí)以上患者中，HR-HPV比例為81.8%，可見(jiàn)HPV分型與病理活檢陽(yáng)性有較好的相關(guān)性，此外，HSIL、LSIL及ASCUS細(xì)胞中各有患者HPV檢測(cè)呈陰性，病理活檢提示均為慢性炎癥，說(shuō)明HPV分型可能更有助于提高細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的特異度，本研究發(fā)現(xiàn)HPV分型對(duì)于CIN的靈敏度與特異度較好，符合率達(dá)90%，說(shuō)明HPV高危型與病理活檢CIN之間有較高的一致性，與前人研究一致〔17,18〕。kappa值及正確指數(shù)為74%和0.75，這可能是由于高危HPV也分為多種基因型造成的診斷結(jié)果可重復(fù)性不佳的緣故，后續(xù)研究需要進(jìn)一步對(duì)高危HPV進(jìn)行細(xì)分以提高kappa值及正確指數(shù)。當(dāng)下CIN 1級(jí)患者可以保守觀察，約60%的患者可自行消退，但CIN 2級(jí)以上病變屬于宮頸癌癌前病變，需要積極處理〔19〕，本研究顯示HPV分型對(duì)CIN 2級(jí)以上病變的診斷價(jià)值，其靈敏度及特異度也在80%以上。鑒于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查現(xiàn)已廣泛用于宮頸癌篩查，我們將HPV分型與細(xì)胞學(xué)檢查進(jìn)行并聯(lián)診斷〔20〕，合并后對(duì)于診斷CIN及高級(jí)別CIN的靈敏度達(dá)到了100%，顯著增加了宮頸癌癌前病變的篩查效能。

本研究尚存在一些不足：(1)本研究未對(duì)高危HPV基因型進(jìn)行進(jìn)一步分型，導(dǎo)致診斷試驗(yàn)可重復(fù)性及正確指數(shù)稍顯不足，需要后續(xù)研究加以補(bǔ)充；(2)本研究樣本量還需進(jìn)一步擴(kuò)大以明確HPV分型及細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)的篩查效能；(3)后續(xù)還應(yīng)進(jìn)一步觀察高危型HPV在宮頸癌前病變基礎(chǔ)上與宮頸癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)，已明確其危險(xiǎn)程度及其與年輕患者的對(duì)比，以便在臨床工作中深化對(duì)于老年患者的HPV篩查及宮頸癌防治。

綜上，宮頸分泌物檢測(cè)HPV基因型對(duì)于發(fā)現(xiàn)高危HPV基因型感染并聯(lián)合細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)篩查老年宮頸癌癌前病變有較好的診斷效能。