陳林林 李中煉 萬(wàn)登峰 曹文鋒 左月明 張忠立

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 1藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心；3江西省人民醫(yī)院)

延齡草是傳統(tǒng)名貴中藥，也是恩施土家族民間藥之一〔1〕，其味甘、性平、有小毒，具有延年益壽的功效，主治頭暈?zāi)垦?、跌打損傷、神經(jīng)衰弱、腦震蕩后遺癥等疾病〔2〕。現(xiàn)代藥理研究具有抗氧化、抗衰老、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用〔3，4〕。有研究發(fā)現(xiàn)，頭頂一顆珠中提取的總甾體皂苷可減輕中動(dòng)脈栓塞致局灶性腦缺血大鼠組織損傷，改善神經(jīng)病理學(xué)及神經(jīng)血管單元微結(jié)構(gòu)改變，增加缺血腦區(qū)血流灌注，促進(jìn)神經(jīng)功能的重塑〔5〕。本研究組前期通過(guò)改良Zea Longa線栓法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注(I/R)損傷模型，研究證實(shí)延齡草抗腦I/R損傷的有效部位為85%乙醇洗脫物，并從中分離得到指標(biāo)性和特征性4個(gè)甾體皂苷類單體化合物。本研究探討延齡草中4個(gè)甾體皂苷類單體成分抗腦I/R損傷作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠96只，體重240～280 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK(湘)2016-0002。

1.2藥物及試劑 偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y2T組)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)〕-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y3T組)、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-〔α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)〕-β-D-吡喃葡萄糖苷(Y4T組)、偏諾皂苷元(YP組)均由本實(shí)驗(yàn)室自行制備(純度均大于98%)；尼莫地平片(Lot170107)購(gòu)于亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；銀杏葉片(Lot 20170320)購(gòu)于南京易亨制藥有限公司。

1.3主要儀器 Thermo D-37520臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；UV8100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)萊伯泰科有限公司)；RM2255切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；ELX800酶標(biāo)儀(Bio Tek公司)；BX43三目Olympus顯微鏡(上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.4方法

1.4.1分組及給藥 SD大鼠隨機(jī)分為12組：假手術(shù)組(Sham組)，模型組(I/R組)，尼莫地平片組10 mg/kg(Contrast 1組)，銀杏葉片組60 mg/kg(Contrast 2組)，Y2T中劑量組60 mg/kg(Y2TM組)，Y2T高劑量組90 mg/kg(Y2TH組)，Y3T中劑量組60 mg/kg(Y3TM組)，Y3T高劑量組90 mg/kg(Y3TH組)，Y4T中劑量組60 mg/kg(Y4TM組)，Y4T高劑量組90 mg/kg(Y4TH組)，偏諾皂苷元中劑量組37 mg/kg(YPM組)，偏諾皂苷元高劑量組54 mg/kg(YPH組)，連續(xù)灌胃給藥8 d，第8天灌胃1 h后，制備腦I/R模型。Sham組和I/R組用蒸餾水灌胃。

1.4.2造模 末次給藥1 h后，應(yīng)用改良Zea Longa線栓法建立大腦中動(dòng)脈阻塞法(MCAO)制備局灶性腦I/R模型〔6，7〕。大鼠全麻(水合氯醛腹腔注射)后固定，頸中部縱向切開(kāi)皮膚2 cm，鈍性分離皮下組織與肌肉，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，小心剪開(kāi)包裹CCA及迷走神經(jīng)的鞘膜，并繼續(xù)分離右頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及右頸外動(dòng)脈(ECA)。在CCA 近心端、遠(yuǎn)心端分別穿線，近心端系緊，結(jié)扎CCA，遠(yuǎn)心端系一松結(jié)備用。分離ECA、ICA，并在ECA穿線結(jié)扎，用動(dòng)脈夾夾閉ICA。距CCA分叉處約4 mm剪一“V”形小口，插入栓線，用備用的絲線打一正結(jié)，松開(kāi)ICA 的動(dòng)脈夾，然后調(diào)整線栓角度，使線栓弧度水平向外，輕輕將線栓送入顱內(nèi)，輕緩?fù)七M(jìn)直至感覺(jué)到阻力，插入深度在18.0～20.0 mm，即完成了大腦中動(dòng)脈阻塞所致大腦局灶性腦缺血的制備。分層縫合肌肉與皮膚(部分栓線留體外)。于2 h 后輕輕地向外拔出栓線1 cm左右至略感阻力即可進(jìn)行再灌注4 h，剪斷皮膚外露的栓線。Sham組不插入線栓，其余同I/R組。

1.5指標(biāo)測(cè)定

1.5.1一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察并記錄飲食、飲水情況及精神狀態(tài)。

1.5.2神經(jīng)功能評(píng)分 參照Z(yǔ)ea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行盲評(píng)：0分：沒(méi)有神經(jīng)功能缺損；1分：對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展，為對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲；2分：行走時(shí)大鼠向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈、劃圈，將大鼠置于地面時(shí)，推動(dòng)患側(cè)肩向?qū)?cè)移動(dòng)時(shí)，阻力明顯降低；3分：行走時(shí)大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒；4分：意識(shí)喪失，不能自發(fā)行走；5分：死亡。評(píng)分在1～3者，確定大鼠造模成功，納入I/R組。

1.5.3大鼠腦指數(shù)的測(cè)定 腦I/R評(píng)分后，大鼠麻醉，取出全腦，生理鹽水沖洗，去除嗅球、小腦及腦干，濾紙吸干水分，稱重。腦指數(shù)=腦濕重(g)/體重(100 g)，可反映血腦屏障結(jié)構(gòu)損傷的情況。

1.5.4大鼠腦梗死體積的測(cè)定 將腦組織稱重后，立即放置-20℃冰箱中快速冷凍20 min，用手術(shù)刀片由前向后行冠狀位切片，共5片，每片約 2 mm厚，置 2% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，37℃避光染色30 min，15 min后翻面。經(jīng)染色正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色，界限清晰。染色后再用4%多聚甲醛固定30 min，拍照，采用Image Pro Plus6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)腦梗灶體積進(jìn)行分析，使用計(jì)數(shù)與測(cè)量工具計(jì)算梗死區(qū)體積及占整個(gè)腦體積的比例。

1.5.5大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)和血清生化指標(biāo)的測(cè)定 大鼠行心臟采血，離心后取血清，測(cè)定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷氨酸、一氧化氮(NO)和Ca2+的含量；部分大鼠取腦組織，測(cè)定大鼠腦組織炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，觀察海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)層病理學(xué)改變。

1.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 Sham組無(wú)神經(jīng)功能缺損，I/R組神經(jīng)功能缺損明顯；Contrast 1組、Contrast 2組、Y2TM組、Y2TH組、Y3TH組、Y3TM組、YPM組、T4TH組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯低于I/R組(P<0.05，P<0.01)。YPH組、Y4TM組神經(jīng)功能缺損與I/R組無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠腦指數(shù)的影響 I/R組大鼠腦指數(shù)明顯高于Sham組，Contrast 2組、Y2TM組、Y3TM組、Y3TH組、Y4TM組及Y4TH組大鼠腦指數(shù)均明顯低于I/R組(P<0.05，P<0.01)；其余各組大鼠腦指數(shù)改善不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3延齡草甾體皂苷單體對(duì)I/R損傷大鼠腦梗死體積的影響 TTC染色結(jié)果顯示(正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈蒼白色，界限清晰)，Sham組未見(jiàn)梗死灶，I/R組出現(xiàn)明顯梗死灶。Contrast 1組、Contrast 2組、Y2TH組、Y2TM組、Y3TH組、Y3TM組、Y4TM組、Y4TH組、YPM組、YPH組梗死灶體積明顯小于I/R組(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦指數(shù)及腦梗死體積的影響分)

圖1 延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠腦梗死TTC染色結(jié)果

2.4延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠血清SOD、MDA和谷氨酸含量的影響 I/R組血清SOD活性明顯低于Sham組，MDA和谷氨酸含量明顯高于Sham組(均P<0.01)；與I/R組比較，Contrast 1組、Contrast 2組、Y2TM組、Y2TH組、Y3TM組、Y3TH組、Y4TM組、Y4TH組、YPM組、YPH組均能使血清SOD活性升高，而使MDA和谷氨酸含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠血清SOD、MDA和谷氨酸含量的影響

2.5延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠血清NO、Ca2+含量的影響 與Sham組相比，I/R組大鼠血清中NO和Ca2+含量明顯升高(P<0.01)；與I/R組比較，Contrast 1組、Contrast 2組、Y2TM組、Y2TH組、Y3TM組、Y3TH組、Y4TM組、Y4TH組、YPM組、YPH組均能使血清NO和Ca2+含量顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠血清NO和Ca2+含量的影響

2.6延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠腦組織海馬區(qū)和皮質(zhì)層區(qū)病理?yè)p傷的影響 常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察腦缺血病理學(xué)變化，Sham組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)層區(qū)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常。I/R組大鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)不完整、腫脹，大量神經(jīng)元丟失、死亡，部分細(xì)胞核溶解、固縮。各給藥組(尤其是Y2TH組、Y3TH組、Y4TH組)大鼠腦組織海馬區(qū)和皮質(zhì)層區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增多，排列較整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近正常，核固縮、壞死明顯減少，說(shuō)明各給藥組對(duì)腦I/R損傷的神經(jīng)細(xì)胞損傷均有顯著改善和保護(hù)作用。見(jiàn)圖2。

圖2 延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠海馬及皮質(zhì)層區(qū)病理學(xué)變化(HE，×400)

2.7延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α的影響 在進(jìn)行腦I/R損傷造模后，與Sham組比較，I/R組腦組織IL-6、IL-1β和TNF-α含量明顯升高(P<0.01)；與I/R組比較，各給藥組腦組織IL-6、IL-1β和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 延齡草甾體皂苷單體對(duì)腦I/R損傷大鼠腦組織IL-6、IL-β和TNF-α含量的影響

3 討 論

腦I/R損傷的病理生理機(jī)制極為復(fù)雜，主要與自由基過(guò)度形成、興奮性氨基酸毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)等有關(guān)，同時(shí)伴有神經(jīng)功能受損、學(xué)習(xí)記憶障礙和腦梗死灶形成等〔8〕。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在治療缺血性腦血管病方面有較大潛力，尤其是中藥單體的生物活性研究得到廣泛開(kāi)展。已有研究證實(shí)延齡草總甾體皂苷具有改善腦I/R損傷的藥理作用〔5〕。

線栓法制備MCAO動(dòng)物模型具有不開(kāi)顱、效果可靠，能準(zhǔn)確地控制缺血及再灌注時(shí)間，對(duì)動(dòng)物自身的生理功能損傷小、術(shù)后生存率高等特點(diǎn)。神經(jīng)功能評(píng)分是評(píng)價(jià)治療腦缺血藥物療效的一項(xiàng)指標(biāo)，可從運(yùn)動(dòng)功能的角度評(píng)價(jià)腦I/R損傷的程度〔9〕。TTC染色法常用于評(píng)估組織的梗死體積〔10〕。本研究結(jié)果提示，延齡草中4個(gè)甾體皂苷類單體成分均能顯著降低腦I/R大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間、減輕I/R部位的病理?yè)p傷，降低腦組織含水量、減少腦梗死體積，減緩腦組織的損傷。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體中活性氧(ROS)產(chǎn)生過(guò)多或者清除能力下降，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡一旦受到破壞，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生潛在的病理性損傷〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，腦I/R損傷時(shí)，機(jī)體可產(chǎn)生大量ROS，這些ROS不能被內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)及時(shí)清除，導(dǎo)致DNA氧化，引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等一系列的連鎖反應(yīng)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，可以改變細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，是研究抗氧化能力的常用指標(biāo)。SOD是自由基清除劑，是對(duì)抗ROS過(guò)多產(chǎn)生的兩種主要酶，其活力能夠間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力〔13〕。腦缺血后引起突觸末梢谷氨酸釋放，激活突觸后膜親離子受體，導(dǎo)致膜去極化，膜興奮性增高，陽(yáng)離子通道開(kāi)放，引起Ca2+大量?jī)?nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，啟動(dòng)一系列酶引起細(xì)胞損傷，其中活化的一氧化氮合酶可催化產(chǎn)生過(guò)量NO，與超氧陰離子形成過(guò)氧亞硝酸根離子和羥基，損傷線粒體膜，致使離子平衡紊亂〔14〕，引起神經(jīng)元的損傷。本研究提示延齡草中4個(gè)甾體皂苷類單體成分能明顯升高M(jìn)CAO大鼠血清中SOD活性，降低MDA含量，抑制谷氨酸的合成和分泌，減少NO和Ca2+的釋放，來(lái)減弱機(jī)體的氧化損傷程度，增加機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，減少神經(jīng)元的損傷。

促炎性細(xì)胞因子是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的重要炎性介質(zhì)。腦缺血可刺激內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞中黏附分子的表達(dá)，產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致白細(xì)胞的黏附及向大腦軟組織外滲〔15〕。本研究結(jié)果表明延齡草中4個(gè)甾體皂苷類單體成分能使MCAO大鼠抑制激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放 TNF-α、IL-1β、IL-6 等多種炎癥因子，提示其對(duì)腦I/R損傷的保護(hù)作用與其抗炎作用有關(guān)。