畢春燕 王保蓮 王文翔 田鵬飛 任國(guó)平

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 1產(chǎn)科三，河南 新鄉(xiāng) 453000；2婦瘤科；3檢驗(yàn)科)

宮頸癌是最常見(jiàn)的女性生殖道惡性腫瘤，在全球婦女常見(jiàn)腫瘤中排第三位，僅次于結(jié)腸癌和乳腺癌，在發(fā)展中國(guó)家是僅次于乳腺癌居第二位的常見(jiàn)腫瘤。世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增病例53萬(wàn)例，因?qū)m頸癌死亡的女性約有25萬(wàn)例，并且高發(fā)地區(qū)扔是發(fā)展中國(guó)家，占全球的80%以上〔1，2〕?？梢钥闯鰧m頸癌對(duì)全球廣大女性的健康已造成嚴(yán)重威脅，因此闡明宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，對(duì)改善宮頸癌的診斷方法和提高療效意義重大。

Wnt通路拮抗基因(DKK)3是Dickkopf家族的一種分泌性糖蛋白，是Wnt信號(hào)通路的拮抗因子〔3〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，DKK3在多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中低表達(dá)，如在乳腺癌、骨腫瘤、胃腸道腫瘤、卵巢癌、肝癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)〔4〕，并作為抑癌基因參與相應(yīng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明，DKK3在宮頸鱗癌、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)，低表達(dá)DKK3患者的生存率明顯下降，且DKK3表達(dá)量隨著組織分期程度的升高而降低〔5，6〕，DKK3過(guò)表達(dá)可抑制β-catenin的表達(dá)，且過(guò)表達(dá)DKK3可抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)〔7〕。最近的研究指出，miR-92a通過(guò)抑制DKK3表達(dá)在一定程度可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的存活和侵襲〔8〕。DKK3影響宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體機(jī)制尚不完全清楚，有關(guān)DKK3對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道，因此本課題就DKK3對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及可能的分子機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1材料 宮頸癌Hela、SiHa細(xì)胞株和正常宮頸Ect1/E6E7細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone；胎牛血清和脂質(zhì)體Lipofectamine2000均購(gòu)于Thermo；Trizol RNA 提取試劑購(gòu)于康為世紀(jì)；DKK3和GAPDH及相關(guān)抗體購(gòu)于Santa Cruz，它們各自引物序列由南京金斯瑞公司合成；Cell Lysis Buffer裂解液、結(jié)晶紫染色液、蛋白濃度測(cè)定試劑盒和蛋白抽提試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；CCK-8試劑和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于南京凱基公司；Transwell小室購(gòu)于Millipore。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基對(duì)宮頸癌Hale、SiHa細(xì)胞和正常宮頸癌Ect1/E6E7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)置培養(yǎng)箱的培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2、相對(duì)濕度90%。細(xì)胞培養(yǎng)密度為(1～10)×105/cm2，呈貼壁生長(zhǎng)，每2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RT-PCR檢測(cè) 利用TRIzol試劑提取Hela、SiHa和Ect1/E6E7細(xì)胞中總RNA，并以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中DKK3和內(nèi)參GAPDH引物序列根據(jù)NCBI GenBank中人源cDNA序列，由南京金斯瑞公司合成，相關(guān)引物序列如下：DKK3正義鏈：5′-GATGCCCTTGTGCCAGT-3′，反義鏈：5′-TGCCAACTTCATACTCATCGG-3′；GAPDH正義鏈：5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，反義鏈：5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′。以GAPDH作內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。每個(gè)樣品孔重復(fù)檢測(cè)3次，取均值。

1.2.3Western印跡檢測(cè) 采用Cell Lysis Buffer 裂解細(xì)胞，提取總蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定樣品的濃度。按4∶1比列混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5×)沸水浴變性后，取120 μg變性蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)膜。在4℃下，將封閉后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入已稀釋的一抗(1∶1 000)中反應(yīng)24 h。在Western洗滌液洗膜后，再在37℃下將PVDF膜轉(zhuǎn)入稀釋的二抗(1∶2 000)中反應(yīng)2 h。避光條件下滴入發(fā)光劑顯影，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image J分析目的條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白的表達(dá)以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela、SiHa和Ect1/E6E7細(xì)胞，并以適當(dāng)密度接到6孔板上。在培養(yǎng)細(xì)胞到細(xì)胞融合度為70%時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明將轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)DKK3的真核載體和pcDNA3.1空白載體分別轉(zhuǎn)染到宮頸癌Hela細(xì)胞中，并分別標(biāo)記為pcDNA3.1-DKK3組和pcDNA3.1組。轉(zhuǎn)染6 h后換為含血清的新鮮培養(yǎng)液，再培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果(參照1.2.2中的方法)。后續(xù)試驗(yàn)中，將Hela細(xì)胞隨機(jī)分為si-DKK3組(轉(zhuǎn)染沉默DKK3的siRNA)、si-NC組(轉(zhuǎn)染沉默DKK3的陰性對(duì)照)、si-IL-32組(轉(zhuǎn)染沉默IL-32的siRNA)、si-NC組(轉(zhuǎn)染沉默IL-32的陰性對(duì)照)、pcDNA3.1-DKK3+pcDNA3.1組(pcDNA3.1-DKK3載體和pcDNA3.1空載體共轉(zhuǎn)染)、pcDNA3.1-DKK3+ pcDNA3.1-IL-32組(pcDNA3.1-DKK3載體和pcDNA3.1-IL-32載體共轉(zhuǎn)染)六組，采用上述方法轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組Hela細(xì)胞，以每孔3×103個(gè)的密度接種于96孔板中。經(jīng)相應(yīng)處理后繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)時(shí)間截止前2 h加入10 μl CKK-8溶液，放在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中孵育2 h。450 nm波長(zhǎng)處，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 采用AnnexinV/PI雙染法，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求，簡(jiǎn)述步驟如下：消化細(xì)胞后，以1 000 r/min離心10 min，加入結(jié)合緩沖重懸細(xì)胞。避光及室溫條件下加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)，10 min后加入碘化丙啶(PI)染液，再染色5 min，后在激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm的條件下上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)如下：實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，離心后去上清，往上室內(nèi)加入200 μl密度為2×108/L細(xì)胞懸液，下室加入500含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，將小室置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，24 h后取出上室，棉簽擦去上室細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室內(nèi)的細(xì)胞15 min；用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，再用0.1%結(jié)晶紫染色5 min，后用蒸餾水漂洗吹干后拍照。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)前用25 mg/L Matrigel 1∶4稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干，后續(xù)步驟則同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析，SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1DKK3在宮頸癌Hela、SiHa細(xì)胞中表達(dá)下調(diào) 與正常宮頸癌Ect1/E6E7細(xì)胞相比，宮頸癌Hela、SiHa細(xì)胞中DKK3 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 DKK3在宮頸癌Hela、SiHa細(xì)胞及正常宮頸Ect1/E6E7細(xì)胞中的表達(dá)情況

圖1 DKK3蛋白的表達(dá)

2.2過(guò)表達(dá)DKK3對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 pcDNA3.1-DKK3組細(xì)胞中DKK3的蛋白表達(dá)水平顯著高于pcDNA3.1組(P<0.05)，成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)DKK3的Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，兩組細(xì)胞的OD值差異不顯著，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h后pcDNA3.1-DKK3組的OD值較pcDNA3.1組明顯下降(P<0.05)；pcDNA3.1-DKK3組的細(xì)胞凋亡水平較pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05)，且DKK3過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞中Bax表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，可見(jiàn)DKK3抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 過(guò)表達(dá)DKK3對(duì)宮頸癌 Hela 細(xì)胞活性凋亡及蛋白表達(dá)的影響

2.3DKK3抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的遷移和侵襲pcDNA3.1-DKK3組細(xì)胞遷移和侵襲量明顯低于pcDNA3.1組(P<0.05)。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DKK3組中E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，可見(jiàn)DKK3過(guò)表達(dá)顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲。見(jiàn)表2、圖3。

圖3 過(guò)表達(dá) DKK3 對(duì)宮頸癌細(xì)胞 Hela 遷移、侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)及蛋白表達(dá)的影響

表2 過(guò)表達(dá) DKK3 對(duì)宮頸癌 Hela 細(xì)胞活性、凋亡、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4DKK3負(fù)向調(diào)控IL-32β的表達(dá) pcDNA3.1-DKK3組Hale細(xì)胞中IL-32β的表達(dá)水平(0.21±0.02)較pcDNA3.1組顯著下降(0.57±0.04，P<0.05)，si-DKK3組Hale細(xì)胞中IL-32β的表達(dá)水平(1.02±0.07)較si-NC組顯著升高(0.58±0.04，P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 IL-32β的表達(dá)

2.5IL-32β促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并抑制細(xì)胞凋亡 si-IL-32β組IL-32β蛋白表達(dá)量較si-NC組顯著下降(P<0.05)，可見(jiàn)沉默IL-32β的Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染24 h后，si-IL-32β組和si-NC組的OD值差異不明顯，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，si-IL-32β組的OD值較si-NC組顯著下降(P<0.05)，可見(jiàn)沉默IL-32β能抑制細(xì)胞增殖。與si-NC組相比，si-IL32β組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率顯著上升，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，可見(jiàn)沉默IL-32β對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。與si-NC組相比，si-IL-32β組MMP-2蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著下降，E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著上升(均P<0.05)，可見(jiàn)沉默IL-32β對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲具有抑制作用。見(jiàn)表3，圖5。

圖5 抑制IL-32β對(duì)宮頸癌 Hela 細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

表3 抑制IL32β對(duì)宮頸癌 Hela 細(xì)胞活性、凋亡、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6過(guò)表達(dá)IL-32β能逆轉(zhuǎn)DKK3對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DKK3組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與pcDNA3.1-DKK3+pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DKK3+pcDNA3.1-IL-32β組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著上升，細(xì)胞凋亡率顯著下降(均P<0.05)。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DKK3組細(xì)胞中IL-32β、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)量顯著下降，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著上升(均P<0.05)；與pcDNA3.1-DKK3+pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DKK3+pcDNA3.1-IL-32β組細(xì)胞中IL-32β、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)量顯著上升，Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量著下降(均P<0.05)。見(jiàn)圖6，表4。

1～4： pcDNA3.1組、pcDNA3.1-DKK3組、pcDNA3.1-DKK3+pcDNA3.1組、pcDNA3.1-DKK3+pcDNA3.1-IL-32β組圖6 過(guò)表達(dá)IL-32β影響 DKK3 對(duì) Hela 細(xì)胞蛋白的表達(dá)

表4 過(guò)表達(dá)IL-32β影響 DKK3 對(duì) Hela 細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲及相應(yīng)蛋白表達(dá)的作用

3 討 論

宮頸癌是女性宮頸上皮細(xì)胞癌變而形成的腫瘤，是女性發(fā)病率和病死率最高的生殖道惡性腫瘤。目前宮頸癌的常用治療方法是手術(shù)及放化療，但對(duì)提高宮頸癌患者的生存率效果不顯著〔9〕。目前研究證實(shí)，宮頸癌發(fā)病的重要原因是感染高危型人乳頭瘤病毒(HPV)，但有研究證實(shí)高危型HPV的感染對(duì)宮頸癌的發(fā)生是必要但不是充分條件〔10〕，HPV感染并不足以影響宮頸癌的發(fā)展〔11〕，所以闡述宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，篩選出參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵性靶點(diǎn)，選擇性阻斷腫瘤相關(guān)信號(hào)通路是宮頸癌治療的研究方向。

近年研究發(fā)現(xiàn)，DKK3基因是一種抑癌基因，其mRNA轉(zhuǎn)錄下調(diào)和蛋白表達(dá)缺失存在于多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中〔12〕。DKK3首先是因?yàn)樵谀[瘤中的作用而被發(fā)現(xiàn)，它通過(guò)抑制wnt信號(hào)途徑中Wnt/MMP-2、Wnt/β-連環(huán)蛋白、Wnt/JNK等通路發(fā)揮抑癌作用，并作為多種腫瘤的抑制劑被人們所熟知〔13,14〕。有研究表明，DKK3在宮頸鱗癌和子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)下調(diào)，且DKK3的表達(dá)量與癌組織分期和預(yù)后有關(guān)，但DKK3對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其具體機(jī)制尚不完全清楚。本研究提示DKK3在宮頸癌中行使抑癌基因的作用。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DKK3的宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖能力顯著下降，細(xì)胞的凋亡率顯著上升，且過(guò)表達(dá)DKK3能促進(jìn)細(xì)胞中相關(guān)凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)。其中Bcl-2家族被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)機(jī)制，其按功能可以分為兩類(lèi)，一類(lèi)像Bcl-2具有抑制凋亡作用，另一類(lèi)像Bax具有促進(jìn)凋亡作用〔15〕。上述實(shí)驗(yàn)表明DKK3能延緩宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)與先前研究結(jié)果一致〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DKK3組細(xì)胞的侵襲和遷移能力顯著下降，并過(guò)表達(dá)DDK3能顯著促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞中相關(guān)侵襲蛋白E-cadherin的表達(dá)，抑制MMP-2的表達(dá)。其中E-cadherin是鈣黏素家族的重要成員，能介導(dǎo)細(xì)胞間連接、維持細(xì)胞骨架和連接支架穩(wěn)定性，其表達(dá)缺失將導(dǎo)致細(xì)胞間黏附能力下降或者缺失，是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)過(guò)程的關(guān)鍵性因素〔16〕；MMP-2是MMP家族成員，特異性的降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分，是腫瘤侵襲過(guò)程中最重要的MMP〔17〕。上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了DKK3對(duì)宮頸癌的腫瘤抑制功能，但是其相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚。

據(jù)研究表明，炎性因子是腫瘤微環(huán)境的重要成分，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲關(guān)系密切〔18〕。IL-32是一種細(xì)胞因子可誘導(dǎo)IL-1β、IL-6等炎性介質(zhì)的表達(dá)來(lái)起到抗炎或者促炎作用，且其可以通過(guò)不同信號(hào)通路如MMP-2、核因子(NF)-κB等來(lái)影響胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌等腫瘤的增殖、凋亡、遷移和侵襲〔19,20〕。IL-32可提高宮頸癌細(xì)胞C33A在低氧低糖條件下的生存率，通過(guò)提高血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)水平來(lái)提升C33A細(xì)胞對(duì)低氧低糖環(huán)境的耐受〔21〕。IL-32β是IL-32主要的亞型，本研究說(shuō)明DKK3負(fù)向調(diào)控IL-32β的表達(dá)。此外，沉默IL-32β抑制了宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲及促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，且沉默IL-32β促進(jìn)Hela細(xì)胞中Bax、E-cadherin的表達(dá)，抑制Bcl-2、MMP-2的表達(dá)，其對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的影響與DKK3恰好相反，提示DKK3可能是通過(guò)負(fù)調(diào)控IL-32β來(lái)影響宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)IL-32β可以逆轉(zhuǎn)DKK3對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖凋亡、遷移和侵襲的影響。