王朋濤，梁秀麗，徐盟龍，趙福杰，閆曉光，魏戰(zhàn)勇, 3*

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 安陽工學(xué)院，河南 安陽 455000；3. 河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

干擾素(interferon, IFN)是一類具有抗病毒、抑制細(xì)胞增殖等多功能糖蛋白，在適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用[1]。干擾素在病原入侵機(jī)體時(shí)誘導(dǎo)相關(guān)抗病毒蛋白的表達(dá)，例如：蛋白激酶R、干擾素誘導(dǎo)黏病毒抵抗蛋白等[2-4]，使機(jī)體處于抗病毒狀態(tài)。干擾素廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)，在藍(lán)耳病、口蹄病等病毒性疾病治療中效果顯著[5-6]。

豬α干擾素基因編碼166個(gè)氨基酸，其空間結(jié)構(gòu)主要由5個(gè)α螺旋組成，無內(nèi)含子，有至少17個(gè)亞型[7-8]。豬α干擾素在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，但表達(dá)量較低，無法滿足生產(chǎn)需要[9]。因此許多學(xué)者利用基因工程對(duì)豬α干擾素進(jìn)行研究。Lefevre等[10]對(duì)豬α干擾素進(jìn)行體外克隆、基因序列分析和少量表達(dá)。陳濤等[11]改變豬α干擾素第86 位氨基酸, 并對(duì)其密碼子進(jìn)行優(yōu)化，獲得蛋白活性為52 000 IU/mg的突變體。李爽等[12]改變豬α干擾素不同的氨基酸活性位點(diǎn)，獲得了蛋白活性為2.97× 108IU/mg的突變體。本研究將天然豬α干擾素的第58位組氨酸H、59位谷氨酸E及61位亮氨酸L分別突變?yōu)槔野彼醂、天冬氨酸N及絲氨酸S，成功構(gòu)建了豬α干擾素YNS突變體，運(yùn)用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)純化后，其抗病毒活性與天然豬α干擾素相比明顯提高，為干擾素的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

含有豬α干擾素基因的重組質(zhì)粒、原核表達(dá)載體pET-32a、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH-5α和Rosetta(DE3)由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞與病毒

Vero細(xì)胞和水泡性口炎病毒(VSV-Indiana)由中科院武漢病毒研究所惠贈(zèng)。

1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，豬α干擾素單克隆抗體(G16，Santa Cruz)購自北京百奧曼科技有限公司，羊抗鼠IgG(HRP標(biāo)記)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)豬α干擾素基因(登陸號(hào)：AB369102.1)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物, 其中F1和R1用于擴(kuò)增完整的豬α干擾素基因并包含BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，W1和W2反向互補(bǔ)且包含突變位點(diǎn)(表1)。引物由鄭州尚亞生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 豬α干擾素YNS突變體基因的擴(kuò)增

以豬α干擾素基因重組質(zhì)粒為模板，利用F-1、W-1和W-2、R-1兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段命名為P1和P2。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，以F-1、R-1為引物，以P1、P2為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如上。反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.6 重組表達(dá)載體pET-32a-IFN-α的構(gòu)建

用BamHⅠ、XhoⅠ分別對(duì)PCR產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，16 ℃連接。轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并送至武漢奧科生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.7 重組質(zhì)粒pET-32a-IFN-α的表達(dá)及鑒定

將鑒定正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)至表達(dá)菌Rosetta中，挑選陽性克隆，37 ℃、200 r/min 振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8，加入IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)8 h。收集菌體進(jìn)行超聲波裂解，4℃、12 000 r/min離心，取沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和Western blot鑒定。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的純化

經(jīng)超聲波破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心，4 mol/L尿素(無菌PBS配制)洗滌沉淀3次以除去雜蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心。取適量的6 mol/L尿素溶解沉淀，分別用5、4、3、2、1 mol/L尿素溶液依次透析，每個(gè)階段6 h，最后用無菌的PBS(pH 7.2)透析24 h。測(cè)定蛋白含量，-80 ℃保存。

1.9 蛋白內(nèi)毒素測(cè)定

利用ToxinSensorTM內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒(L00350)檢測(cè)純化后干擾素內(nèi)毒素的含量，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.10 干擾素的生物活性測(cè)定

VSV的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)測(cè)定：將Vero細(xì)胞接種到96孔板中， 24 h后每孔加入10倍倍比稀釋的VSV病毒100 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

MTT法檢測(cè)干擾素在Vero細(xì)胞上的安全濃度：利用MTT試劑盒(索萊寶M1020-500T)檢測(cè)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在OD490nm處測(cè)量生物活性。

抗病毒活性的測(cè)定：采用細(xì)胞病變(CPE)抑制法在Vero-VSV系統(tǒng)上測(cè)定豬α干擾素突變體蛋白的抗病毒活性。同時(shí)對(duì)VSV的TCID50和基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。將Vero細(xì)胞接種到6孔板中，24 h后每孔加入濃度分別為100 ng/mL和1 ng/mL的干擾素100 μL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)組每孔接入100 TCID50/0.1 mL VSV。培養(yǎng)至病毒對(duì)照組有75%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，分別收取上清和細(xì)胞檢測(cè)。VSV(Real-time pCR)檢測(cè)方法及其標(biāo)準(zhǔn)曲線參照文獻(xiàn)[13]方法建立。引物序列如表1。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

采用Prism 6.0進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)是用平均值顯示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 豬α干擾素突變體的克隆

豬α干擾素突變體基因擴(kuò)增產(chǎn)物，核酸電泳和測(cè)序顯示，擴(kuò)增片段大小符合預(yù)期，長(zhǎng) 501 bp并含有3個(gè)預(yù)期突變位點(diǎn)，與參照序列同源性97.6%。雙酶切鑒定結(jié)果顯示成功構(gòu)建豬α干擾素突變體表達(dá)質(zhì)粒(如圖2)。

M. DL 2000 DNA Marker；1. 片段P1; 2. 片段P2; 3. 豬α干擾素；N. 陰性對(duì)照

M. DL 5000 DNA Marker；1. pET-32a--IFN-α雙酶切產(chǎn)物; 2. pET-32a 雙酶切產(chǎn)物; 3. 豬α干擾素

2.2 重組蛋白的表達(dá)及鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎后，SDS-PAGE檢測(cè)(如圖3)結(jié)果顯示，蛋白分子量約33 kDa，符合預(yù)測(cè)結(jié)果，蛋白表達(dá)形式為包涵體。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與豬α干擾素單克隆抗體和羊抗鼠HRP抗體反應(yīng)，結(jié)果顯示在33 kDa處顯示一條清晰的特異性條帶，與目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量一致(如圖4)。

2.3 內(nèi)毒素檢測(cè)

利用內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)純化后干擾素蛋白內(nèi)毒素的含量。檢測(cè)結(jié)果顯示，豬α干擾素突變體和參考蛋白的內(nèi)毒素(0.8 mg/mL)的檢測(cè)平均值分別為0.59 EU/mL和0.62 EU/mL，符合2015版《中國藥典》中通則1143要求(如圖5)。

M. 蛋白Marker；1. Rosetta；2. pET-32a空載體誘導(dǎo)；3.重組質(zhì)粒pET-32a--IFN-α誘導(dǎo)；4. 沉淀中的重組蛋白；5. 上清中的重組蛋白

M. 蛋白Marker；1. 重組質(zhì)粒pET-32a-IFN-α誘導(dǎo)；2. pET-32a空載體誘導(dǎo)

注：Y表示參照序列蛋白，YNS 表示豬α干擾素YNS突變體。下同

2.4 蛋白生物活性測(cè)定結(jié)

2.4.1 干擾素細(xì)胞安全濃度檢測(cè)

利用MTT法，在Vero細(xì)胞上檢測(cè)干擾素蛋白的安全濃度。結(jié)果表明，豬α干擾素突變體的CC50為462.7 μg/mL，參考序列蛋白的CC50為402.9 μg/mL，二者對(duì)細(xì)胞活性的影響呈現(xiàn)濃度依賴性，倍比稀釋到約25 μg/mL后對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響(如圖6)。

2.4.2 抗病毒活性檢測(cè)結(jié)果

采用細(xì)胞病變抑制法，在Vero/VSV系統(tǒng)測(cè)定豬干擾素的抗病毒活性。檢測(cè)結(jié)果表明，豬α干擾素突變體表現(xiàn)出較高的抗病毒活性，突變體蛋白活性為1.63×106IU/mg。利用TCID50和Real-time PCR測(cè)定病毒滴度和基因拷貝數(shù)，結(jié)果顯示豬α干擾素能夠有效地抑制VSV增殖，與參考序列蛋白相比差異顯著，具有更高的生物活性。

圖6 細(xì)胞活性檢測(cè)

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

圖8 VSV基因拷貝數(shù)測(cè)定

3 討論

豬α干擾素具有速效廣譜的抗病毒效應(yīng)，在預(yù)防和治療病毒性疾病方面發(fā)揮著不可替代的作用[14]。近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者利用原核、真核和桿狀病毒等表達(dá)系統(tǒng)對(duì)干擾素進(jìn)行表達(dá)[15-17]。Lefevre等[8]在大腸桿菌中表達(dá)豬α干擾素，并對(duì)其生物活性檢測(cè)。曹瑞兵等[18]對(duì)豬α干擾素密碼子進(jìn)行優(yōu)化，獲得干擾素蛋白的生物活性為6. 4×106IU/mg。王彥彬等[15]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)干擾素，蛋白在細(xì)胞上有效抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的增殖。Huang等[17]利用基因工程的方法改變豬α干擾素基因并在畢赤酵母中大量表達(dá)，獲得了具有高活性的干擾素。

研究表明，改變?nèi)薎FNα2的3個(gè)氨基酸位點(diǎn)H57Y、E58N和Q61S，可使其活性相比野生型人IFN-α2得到提高[19]。人干擾素α和豬α干擾素同源性高達(dá)70%，因此本試驗(yàn)采用融合PCR的方法克隆包含58、59和61位氨基酸突變位點(diǎn)的豬α干擾素突變體基因，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)突變體，優(yōu)化蛋白純化方式，縮短了純化時(shí)間，更加適合大規(guī)模制備和生產(chǎn)應(yīng)用。

本試驗(yàn)利用試劑盒檢測(cè)純化后的豬α干擾素內(nèi)毒素殘留，結(jié)果表明，內(nèi)毒素含量低于1 EU/mg，符合細(xì)胞因子制品標(biāo)準(zhǔn)。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明突變體蛋白的抗增殖能力呈現(xiàn)濃度依賴性，在蛋白濃度為25 μg/mL時(shí)，不影響Vero細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞無毒性。試驗(yàn)還運(yùn)用TCID50和Real-time PCR方法分別從病毒滴度和病毒基因拷貝數(shù)上探究豬α干擾素抑制VSV增殖的能力。結(jié)果表明，YNS突變體和參照序列蛋白均能顯著降低VSV的病毒滴度和基因拷貝數(shù)，YNS突變體抑制病毒增殖作用更明顯，與參照序列蛋白相比降低約2個(gè)病毒滴度和2log10病毒基因拷貝數(shù)。

王彥彬等[16]，通過對(duì)干擾素與其受體IFNAR2三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，突變豬α干擾素與受體結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)，可以使豬α干擾素與受體更快、更緊密的結(jié)合，從而使干擾素活性增強(qiáng)，但是具體某個(gè)氨基酸的改變對(duì)干擾素活性影響較大，仍需進(jìn)一步探究。

總之，本研究成功構(gòu)建了新型豬α干擾素YNS突變體，表達(dá)純化后具有較高的生物活性，為干擾素的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。