冉 瓊，鐘章成，杜道林

(1.重慶理工大學(xué)，重慶 巴南401320；2.綿陽師范學(xué)院，四川 綿陽 621000；3.西南大學(xué) 三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 北碚 400715；4.江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

0 引 言

叢枝菌根(AM)真菌是一類能與陸地上約80%植物形成共生體的土壤微生物[5]，大多數(shù)植物的根系可與之形成良好的互惠共生關(guān)系，能促使植物吸收營養(yǎng)，促進(jìn)植物生長，還能增強(qiáng)植物的抗病能力[6-7]、抗旱性[8]、抗鹽性[9]、抗溫度脅迫[10]及抗重金屬脅迫[11]等。但目前關(guān)于AM 真菌和鈣毒害效應(yīng)相關(guān)性的研究還鮮有報(bào)道。種植玉米是解決西南喀斯特山區(qū)糧食問題的可行途徑，而如何提高玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量是玉米生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵問題。本研究利用溫室盆栽試驗(yàn)，探討了AM真菌對(duì)高鈣脅迫下玉米生長、光合及生化特性等的影響，旨在探討高鈣脅迫對(duì)玉米的毒害效應(yīng)及AM真菌對(duì)高鈣脅迫的緩解作用，研究結(jié)果可為評(píng)價(jià)喀斯特地區(qū)AM真菌對(duì)高鈣土壤中的植物的促生效應(yīng)及其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可行性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 AM真菌接種體。菌種摩西球囊霉(Glomusmosseae)，購買自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所，接種劑為經(jīng)白三葉草繁殖后產(chǎn)生的菌根菌孢子、根外菌絲體及根際土壤(含有相應(yīng)宿主植物根段)，約300個(gè)孢子· 20g-1。

1.1.2 宿主植物。宿主植物為玉米(ZeamaysL.)，種子來自重慶市酉陽縣巖溶山區(qū)農(nóng)戶提供的自選種，先經(jīng)10% H2O2消毒10 min，接著用無菌水洗凈后置于滅菌后的培養(yǎng)皿(皿底放無菌濕潤的三層濾紙)，再將培養(yǎng)皿放于25 ℃黑箱里催芽，2天后，挑選狀況一致的種芽備用。

1.1.3 培養(yǎng)基質(zhì)與容器。培養(yǎng)基質(zhì)為土沙1∶4(W∶W)混合物。土壤為巖溶地段的石灰土(pH值6.81，含有機(jī)質(zhì)26.8 g·kg-1，堿解氮68 mg·kg-1，速效鉀108 mg·kg-1，交換性鈣2.326 g·kg-1，全鉀14.62 g·kg-1，全磷0.46 g·kg-1，全氮1.34 g·kg-1)，取自重慶北碚雞公；土壤經(jīng)自然風(fēng)干后，過1 mm篩，在溫度124 ℃，壓力0.14 MPa高壓滅菌鍋下連續(xù)滅菌2 h，晾干，再與相同方式下滅菌晾干的干凈河沙均勻混合備用。培養(yǎng)容器采用高16 cm，上口直徑19 cm，下口直徑13 cm的塑料盆，先于0.1%的高錳酸鉀溶液中浸泡30 min，再清洗干凈、晾干。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)包括兩因素，接種處理和鈣處理，接種處理為接菌和不接菌，鈣處理為對(duì)照鈣處理和高鈣處理。采用兩因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，兩因素兩水平，共4個(gè)處理：對(duì)照不接菌處理(C)；對(duì)照接菌處理(C+AMF)；高鈣不接菌處理(H)；高鈣接菌處理(H+AMF)，每個(gè)處理種植7盆，隨機(jī)擺放于大棚內(nèi)。

于2015年4月8日在西南大學(xué)生態(tài)園的大棚內(nèi)進(jìn)行播種，為保障植物正常生長，播種前將復(fù)合肥200 mg·kg-1(N∶P∶K=26∶12∶10)混入基質(zhì)中作基礎(chǔ)養(yǎng)分。試驗(yàn)分為對(duì)照和高鈣處理，對(duì)照處理為培養(yǎng)基質(zhì)不加外源鈣，高鈣處理為培養(yǎng)基質(zhì)添加外源鈣(無水氯化鈣以溶液形式添加混勻)，達(dá)到1.0 g·kg-1[12-13]的鈣離子濃度(不含基質(zhì)中的鈣本底值)。鈣設(shè)置完成后，裝盆，預(yù)計(jì)每盆裝2.5 kg基質(zhì)。先將2.0 kg基質(zhì)裝入培養(yǎng)容器，然后添加滅菌接種物15 g(不接菌處理，同時(shí)添加10 ml 15 g接種物的過濾液，保持其它菌群一致)或接種物15 g(接菌處理)于已盆裝基質(zhì)表面，將5粒玉米種芽植入盆裝基質(zhì)中，最后將余下的0.5 kg基質(zhì)平鋪其上，接種劑與土表距離約2 cm。裝盆過程完成后澆水，盆中基質(zhì)含水量達(dá)到20%(絕對(duì)含水量)為止。試驗(yàn)過程均采用去離子水澆灌，每天稱重維持20%的土壤含水量。出苗7天后間苗，每盆留苗2株，試驗(yàn)開始至第6周時(shí)測(cè)定各指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 玉米幼苗光合參數(shù)及生長指標(biāo)的測(cè)定。于晴朗的上午9:00時(shí)，采用便攜式光合測(cè)定儀Li-6400(LI-COR，USA)測(cè)定玉米幼苗第2-3張完全展開葉片的光合參數(shù)。測(cè)定時(shí)光量子通量密度(PED)為1 200 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為(470±10)μmol·mol-1，溫度為26 ℃，相對(duì)濕度為65%，葉室配備LED紅藍(lán)光源。測(cè)定完成后，用直尺量取植株株高，再將花盆連同植株浸入水中，小心取出植株，先用自來水沖掉根部土壤和沙礫，再用蒸餾水緩緩洗凈植株表面，最后用吸水紙吸干植株表面水分，并將其帶回實(shí)驗(yàn)室。將各處理3-5個(gè)植株進(jìn)行根、莖、葉器官分離，放至105 ℃烘箱內(nèi)殺青30 min，70 ℃烘干72 h后進(jìn)行稱重，根、莖、葉生物量之和為總生物量，莖、葉生物量之和為地上生物量，根生物量與地上生物量之比即為根冠比。

1.3.2 玉米幼苗根系侵染率的測(cè)定。根系侵染率的測(cè)定參照Phillips和Hayman的方法[14]，將切成1 cm的玉米小根段，用曲利苯藍(lán)0.05%濃度的染色液染色，菌根侵染率為侵染根段長占總根段長的百分比。

1.3.3 玉米幼苗葉生化指標(biāo)的測(cè)定。脯氨酸的測(cè)定—磺基水楊酸法，參照章家恩[15]方法進(jìn)行。

可溶性糖的測(cè)定參照張志良等[16]的比色法進(jìn)行。

丙二醛含量的測(cè)定參照章家恩[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，LSD多重比較5%水平下檢驗(yàn)不同處理平均值間的差異顯著性，采用Microsoft Office Excel 2007和Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣脅迫下AM真菌對(duì)玉米幼苗生長和光合參數(shù)的影響

由表1可知，高鈣處理下玉米幼苗的菌根侵染、總生物量、地上生物量、株高及根冠比均顯著低于對(duì)照處理(P<0.05)，表明高鈣顯著抑制了玉米根系的侵染能力和生長。對(duì)照條件下，接菌處理顯著增加玉米幼苗總生物量、地上生物量、株高，分別提高了31.8%、40.8%和10.3%(P<0.05)；然而，高鈣條件下，接菌處理未使玉米幼苗的總生物量、地上生物量、株高及根冠比產(chǎn)生顯著變化。

表1 不同處理下玉米幼苗的菌根侵染率和生長特征Table 1 The AMF colonization ratio and growth of maize seedlings under different treatments

由圖1可知，與對(duì)照處理相比，高鈣處理顯著降低了玉米幼苗的凈光合速率、蒸騰速率以及氣孔導(dǎo)度(P<0.05)，表明高鈣脅迫抑制了玉米幼苗的光合能力。對(duì)照條件下，接菌處理分別使玉米幼苗凈光合速率、蒸騰速率以及氣孔導(dǎo)度顯著提高22.3%、15.4%、32.2%(P<0.05)；然而，高鈣條件下，接菌處理未對(duì)玉米幼苗的光合參數(shù)產(chǎn)生顯著影響。

圖1 不同處理下玉米幼苗的光合參數(shù)Fig.1 The photosynthetic characteristics of maize seedlings under different treatments

2.2 鈣脅迫下AM真菌對(duì)玉米幼苗可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量的影響

可溶糖含量是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)照條件下，接菌處理顯著提高了玉米幼苗可溶性糖含量(P<0.05)；高鈣脅迫顯著降低了玉米幼苗的可溶性糖含量(P<0.05，圖2)；高鈣條件下，接菌處理未使玉米幼苗的可溶性糖含量產(chǎn)生顯著變化。

圖2 不同處理下玉米幼苗可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量的影響Fig.2 The soluble sugar,proline and MDA contents of maize seedlings under different treatments

脯氨酸含量大小可以反映植物受害程度的高低，與對(duì)照處理相比，高鈣處理下玉米幼苗的脯氨酸含量顯著增加，表明高鈣處理下玉米幼苗的受害程度遠(yuǎn)高于對(duì)照處理(圖2)。對(duì)照與高鈣脅迫下，接菌處理均對(duì)脯氨酸含量影響不顯著。

丙二醛是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量越低細(xì)胞膜的完整性和穩(wěn)定性越好。鈣濃度增加，丙二醛有降低趨勢(shì)，鈣在一定程度上能穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。對(duì)照鈣處理下，接菌處理較未接菌處理玉米幼苗的丙二醛含量理顯著下降(P<0.05)(圖2)，表明AM真菌能夠使植物細(xì)胞膜保持更加好的完整性和穩(wěn)定性；高鈣下接菌處理未對(duì)丙二含醛含量產(chǎn)生顯著影響。

3 討 論

AM真菌是一類能與絕大部分植物的根系形成互惠共生體的微生物。魏源等[29-30]發(fā)現(xiàn)，AM真菌的生態(tài)學(xué)功能與喀斯特生態(tài)系統(tǒng)的限制因子間有良好的耦合關(guān)系，AM真菌與宿主植物之間有著雙向的選擇性，侵染率是彼此間親和力的體現(xiàn)，親和力好，則侵染率高；親和力差，則侵染率低。本研究表明，典型喀斯特土壤，鈣含量超過中鈣水平鈣脅迫的植株相對(duì)于高鈣脅迫的植株更容易與AM真菌形成共生體。鈣濃度增加對(duì)AM真菌不規(guī)則發(fā)育具有負(fù)面影響，能顯著降低AM真菌不規(guī)則生長周期的主要階段，包括孢子萌發(fā)、萌發(fā)菌絲伸長、根定植、根外菌絲發(fā)育和孢子形成，但不能完全抑制其生長[31]。

AM真菌在鹽脅迫下能提高玉米生長和光合能力[32]，我們的數(shù)據(jù)表明，過高鈣水平不利于玉米植株的生長，這種效應(yīng)在菌根中比在非菌根中更強(qiáng)烈，這可能與菌根分配相當(dāng)一部分碳以維持真菌代謝有關(guān)[33-34]。叢枝菌根定植在過高鈣情況下不能提供植物更好的生長，這一結(jié)果與許多表明叢枝菌根共生在其他幾種非生物脅迫下對(duì)植物生長有益的研究并不一致[35-37]。Hoffland等[38]和Van Scholl等[39]報(bào)道稱，菌根內(nèi)真菌從巖石中吸收鈣的能力非常小，由此可能緩解鈣毒效應(yīng)。

高鈣會(huì)導(dǎo)致礦物質(zhì)養(yǎng)分生物利用度低，尤其是磷[40]和鐵[41]，因此，這些缺陷會(huì)影響植物根部和葉片的代謝過程[42]。糖是一種重要的代謝產(chǎn)物，植物在各種應(yīng)激因子的作用下，利用糖進(jìn)行防御反應(yīng)，環(huán)境壓力誘導(dǎo)可使可溶性糖含量變化，本研究結(jié)果顯示，高鈣顯著降低了可溶性糖含量。對(duì)照鈣處理下AM真菌促進(jìn)了可溶性糖的積累，AM真菌需要從宿主植物獲得糖分來促進(jìn)自身生長[43]，也會(huì)促進(jìn)植株體內(nèi)淀粉的分解[44]，因此能使宿主植物可溶性糖含量增加，但高鈣脅迫下，AM真菌未對(duì)可溶性糖含量產(chǎn)生顯著影響。

脯氨酸是植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物，許多植物在鹽脅迫的條件下積累脯氨酸可作為無毒和保護(hù)性的滲透物來維持滲透平衡[45-47]，因此其積累量的高低可以反映植物抗逆性的強(qiáng)弱。AM真菌還可通過增加宿主植物體內(nèi)脯氨酸的積累量，提高植物的耐鹽性[48]。本研究結(jié)果顯示，鈣濃度增加促使脯氨酸含量顯著提高，但AM真菌對(duì)脯氨酸含量的積累無顯著影響。

MDA含量是評(píng)估氧化膜損傷的有效手段[49-50]，脂質(zhì)過氧化作用被認(rèn)為是植物抗非生物脅迫的關(guān)鍵過程之一。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照鈣處理下，叢枝菌根可以減輕膜脂過氧化。菌根定植對(duì)根系保護(hù)可能與誘導(dǎo)活性氧清除系統(tǒng)減少活性氧生成有關(guān)，在應(yīng)激反應(yīng)中最常見的解毒ROS合成器的機(jī)制中，POD誘導(dǎo)已經(jīng)在幾項(xiàng)研究中得到報(bào)道[51]。

綜上所述，過高鈣含量土壤基質(zhì)抑制了植物的生長和光合生理等過程，AM真菌在部分喀斯特土壤中仍能促進(jìn)植物的生長、光合及代謝過程，鈣過高環(huán)境下，AM真菌不能促進(jìn)植物的生長生理過程，一方面與高鈣脅迫抑制了菌根真菌的生長和生理過程，菌根真菌沒有參與鈣的吸收、對(duì)鈣毒效應(yīng)的緩解效應(yīng)不顯著有關(guān)，另外，不同土壤環(huán)境和菌種會(huì)導(dǎo)致不同的接種效應(yīng)，且不同菌種與寄主間侵染時(shí)期及親和性也使接種效應(yīng)具有差異性，玉米根際AM真菌豐富多樣[52]，種類不同，促進(jìn)植物生長發(fā)育的效果有差異[53]。

本研究探究了土壤高鈣對(duì)AM真菌和寄主植物之間的相互作用的影響，過高鈣濃度抑制了植物的生長及光合等生理過程，也對(duì)AM真菌的定植產(chǎn)生了影響，AM真菌定植未顯著緩解過高鈣毒效應(yīng)。由于目前高鈣脅迫下的菌根效應(yīng)關(guān)注比較少，有關(guān)AM 真菌減緩鈣離子對(duì)植物毒害作用的機(jī)制，目前尚無定論，對(duì)于喀斯特地區(qū)鈣與土壤AM植物系統(tǒng)相互作用的因果關(guān)系仍有許多未解之謎。異質(zhì)性是巖溶生境中土壤的重要特點(diǎn)，多重脅迫往往在該生境中共同存在，因此探討異質(zhì)生境與多重脅迫下植物的適應(yīng)性及菌根效應(yīng)，是今后研究需努力的方向。