張小敏，郭 波，段寶敏，馮敬敬，李 嘉，雷向東，陳家锃

（天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司,天津 300000; 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司, 天津 300000)

豬藍(lán)耳?。≒RRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染性疾病，是一種免疫抑制病，常繼發(fā)或并發(fā)感染豬鏈球菌、鼻支原體、胸膜肺炎放線桿菌病[1]。豬傳染性胸膜肺 炎(Porcine contagious pleuro pneumia， APP)是由胸膜肺炎放線桿菌引起以出血性纖維素性胸膜肺炎為病理特征的一種高度接觸傳染性呼吸道傳染病，能引起豬急性纖維素性胸膜肺炎或慢性局灶性壞死性肺炎。豬傳染性胸膜肺炎不分年齡階段，各性別豬均易感染。給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。

2020年2月，山西某大型規(guī)模豬場(chǎng)一批體重40 kg左右的育肥豬表現(xiàn)呼吸困難，無(wú)過(guò)多癥狀表現(xiàn)，即突然死亡，發(fā)病率為2%，死亡率1.5%左右。根據(jù)死亡豬與病豬的臨床癥狀綜合診斷，初步懷疑病豬為豬繁殖與呼吸綜合征并發(fā)APP感染引起的發(fā)病，為確定感染病原，無(wú)菌采集病死豬的肺臟、肝臟、脾臟病料,做病原RT-PCR檢測(cè)豬繁殖與呼吸障礙綜合征；通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)、鏡檢、PCR檢測(cè)、16SrRNA基因序列進(jìn)化樹構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)室方法對(duì)分離菌進(jìn)行系統(tǒng)分析，為該病的防治提供理論依據(jù)。

1 檢測(cè)方案及治療意見

1.1 病毒RT-PCR鑒定

無(wú)菌采集病料組織，用RTPCR技術(shù)對(duì)提取的病毒 RNA進(jìn)行高致病性豬藍(lán)耳病病毒初步鑒定。以總RNA為模板，Random Primer(6mer) 為引物，在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為5×M-MLV Buffer 8μL，dNTP Mixture(2.5 mM)4μL，Random Primer(6mer)2μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，RNA酶抑制劑0.5μL,cDNA 模板25μL。反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃10 min，42 ℃1 h，72 ℃15 min，冷卻至室溫，-20 ℃保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：ddH2O 11.6μL，10 ×PCR Buffer 2μL，DNTP1.6μL,Taq酶0.3μL， 上、下游引物各1,模板2.5μL加去離子水至20μL，混合均勻。PRRSV引物擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸5 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用濃度1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電脈，電泳完畢后于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.2 細(xì)菌分離與鑒定

1.2.1 細(xì)菌分離與純化

無(wú)菌采取肺臟病變部位接種于含1%NAD和5%胎牛血清的TSA瓊脂平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，無(wú)菌挑取單個(gè)菌落進(jìn)行劃線純培養(yǎng)直至平板上長(zhǎng)出的菌落完全一致。

1.2.2 細(xì)菌染色鏡檢

取載玻片一張，用滅菌接種環(huán)取少量菌涂于載玻片上磨勻。使其自然干燥。通過(guò)火焰2～3次固定（以不燙手為宜），染色：結(jié)晶紫—初染：1 min；碘液—媒染1 min；1～2 min 95%乙醇—脫色30 s；復(fù)紅—復(fù)染1 min。

1.2.3 細(xì)菌PCR鑒定

吸取1mL TSB（含5%牛血清+1%NAD）培養(yǎng)基于1.5mL高壓滅菌的離心管中，接種環(huán)滅菌后挑取疑似豬胸膜肺炎單菌落于離心管中，放入搖床中24 h。將營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)物取2μL作為模板，反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 min；然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)，94 ℃1 min、49 ℃ 30 s、72℃ 30 s；最后72 ℃延伸5 min，4℃終止反應(yīng)。

1.2.4 細(xì)菌16SrRNA 核苷酸遺傳進(jìn)化構(gòu)建

將鑒定為豬胸膜肺炎的菌液重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃變性10 min；然后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)，94℃ 1 min、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s；最后72 ℃延伸5 min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物由擎科生物科技有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸的同源性比較及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 分離菌株的藥敏試驗(yàn)

挑取TSA瓊脂培養(yǎng)基（含1%NAD+5%牛血清）上的單個(gè)菌落于TSB（含1%NAD+5%牛血清）液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)約6～8 h后取菌液0.5mL均勻涂布于TSA瓊脂培養(yǎng)基表面，待菌液吸收后均勻貼上安普霉素、安普霉素+氨芐西林、恩諾沙星、硫酸黏菌素、替米考星+氟苯尼考、替米考星+阿莫西林、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉+硫酸黏菌素、頭孢喹肟、頭孢噻呋鈉+新霉素、替米考星+頭孢噻呋鈉、多西環(huán)素、多西環(huán)素+氟苯尼考、頭孢噻呋鈉+阿莫西林、阿莫西林+克拉維酸鉀、頭孢噻呋鈉+恩諾沙星、新霉素、頭孢噻呋鈉、安普霉素+頭孢噻呋鈉19種藥敏紙片置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，參考藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)(WS－T125－1999) 判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果，確定待檢分離菌株對(duì)藥物的敏感性。

1.4 根據(jù)臨床及檢測(cè)結(jié)果制定治療方案及處理意見

2 結(jié)果

2.1 剖檢病變

剖檢豬發(fā)現(xiàn)肺臟淤血、出血、壞死有纖維素性滲出物（見圖1、圖3）肝臟腫大、淤血（見圖2）。

2.2 病毒HP-PRRSV RT-PCR檢測(cè)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，送檢樣品均檢出HP-PRRSV核酸陽(yáng)性。陰、陽(yáng)性對(duì)照成立（見圖4）。

2.3 分離菌株的菌落形態(tài)特征

分離菌株在含 1%NAD和5%胎牛血清的TSA瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)約12 h后形成表面光滑、圓形、凸起、濕潤(rùn)菌落直徑為2～3 mm(見圖5)挑取單菌落進(jìn)行涂片，經(jīng)革蘭氏染色于油鏡下觀察為革蘭氏陰性球桿菌，菌體細(xì)小，也可見桿狀、絲狀散在菌體(見圖6)。

2.4 細(xì)菌PCR 鑒定結(jié)果

挑取疑似副豬胸膜肺炎放線桿菌菌落加入TSB+5%牛血清+1%NAD的液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h搖床培養(yǎng)，用菌液當(dāng)作模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。

PCR檢測(cè)結(jié)果表明，1#APP核酸陽(yáng)性。陽(yáng)性、陰性對(duì)照成立。陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出分子量約為400 bp片段，與預(yù)期片段427 bp大小相符，陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何片段表明擴(kuò)增方法正確，因此PCR鑒定該菌為豬胸膜肺炎放線桿菌（見圖7）。

2.5 分離菌株的16SrRNA基因鑒定結(jié)果

用細(xì)菌16SrRNA通用引物擴(kuò)增目的序列，擴(kuò)增的片段與預(yù)期目的片段1492 bp接近（見圖8）；測(cè)序結(jié)果分析表明:分離菌株(命名為HeB200229)與NCBI上的胸膜肺炎放線桿菌菌株有99.5%～99.7%的同源性(見圖9)，與大腸桿菌菌株84(登錄號(hào):MF399285.1)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[4]（見圖10）。

分離菌株16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，1#16SrRNA核酸陽(yáng)性。陽(yáng)性、陰性對(duì)照成立。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示（見表1）：分離菌株對(duì)安普霉素、硫酸黏菌素、替米考星+氟苯尼考、替米考星+阿莫西林、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉+硫酸黏菌素、頭孢喹肟、頭孢噻呋鈉+新霉素、替米考星+頭孢噻呋鈉、多西環(huán)素+氟苯尼考、頭孢噻呋鈉+阿莫西林、阿莫西林+克拉維酸鉀、頭孢噻呋鈉+恩諾沙星、新霉素、頭孢噻呋鈉、安普霉素+頭孢噻呋鈉敏感；對(duì)恩諾沙星耐藥。

3 臨床及檢測(cè)結(jié)果制定治療方案及處理意見

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果高致病性藍(lán)耳病毒核酸陽(yáng)性及胸膜肺炎放線桿菌核酸陽(yáng)性，結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，制定治療方案及處理意見如下。

3.1 群體防控

每噸飲水添加阿莫西林+克拉維酸鉀500 g和卡巴匹林鈣500 g自由飲水；每噸飼料添加替米考星腸溶顆粒1000 g和復(fù)合維生素1000 g混飼。

3.2 個(gè)體治療

加大巡查頻率和豬群觀察時(shí)間，對(duì)早期發(fā)病豬只采取氟尼辛葡甲胺+氟苯尼考混合肌注，同時(shí)配合注射地塞米松和維生素C。

3.3 后期防控

肺纖毛受損是傳染性胸膜肺炎發(fā)病的必要條件，分析誘發(fā)豬群肺纖毛受損的原因，解決通風(fēng)問題，是否存在氨氣過(guò)多，是否寒冷應(yīng)激或者支原體感染，制定相應(yīng)防控和改善措施。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 小結(jié)

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌引起的豬細(xì)菌性肺炎中危害最大的一種疾病，病原感染后可快速導(dǎo)致各階段豬群纖維出血性、壞死性胸膜肺炎，機(jī)體因吸收大量細(xì)胞壁脂多糖引起內(nèi)毒素休克快速死亡。發(fā)病到死亡一般不超過(guò)3 h，往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已來(lái)不及治療。

肺纖毛受損是發(fā)病的必要條件，主要因寒冷、氨氣過(guò)多，支原體等引起。典型病例出現(xiàn)淺血色泡沫狀鼻涕，非典型病例出現(xiàn)類似流感癥狀；發(fā)病耐過(guò)豬不注意管理可導(dǎo)致后期再暴發(fā)。耐過(guò)豬只應(yīng)單獨(dú)隔離飼養(yǎng)并盡早出欄，如果無(wú)條件隔離飼養(yǎng)的，需要定期對(duì)整個(gè)豬群進(jìn)行藥物預(yù)防，并做好通風(fēng)、換氣和日常消毒工作，防止二次發(fā)病。

本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)臨床癥狀、檢測(cè)結(jié)果及藥敏試驗(yàn)，分別對(duì)發(fā)病豬群飼料、飲水、發(fā)病個(gè)體和群體后期防控制定了治療方案和處理建議，為該豬場(chǎng)豬繁殖與呼吸障礙綜合征并發(fā)豬傳染性胸膜肺炎的臨床診斷及用藥提供了理論依據(jù)。