涂 艷，呂寶乾，章雨璐，蔣方一丁，齊可欣

1海南大學林學院，海南 儋州 571737；2 中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南 儋州 571737；3 農業(yè)農村部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室/海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室，海南 ?？?571101

椰子織蛾OpisinaarenosellaWalker屬鱗翅目Lepidoptera織蛾科Oecophoridae，原產地為印度和斯里蘭卡，現主要分布于東南亞國家和地區(qū)，是一種嚴重危害椰子等30多種棕櫚科植物的害蟲。2013年8月首次在我國海南發(fā)現(呂寶乾等，2013)。雌蛾產卵于棕櫚葉背面，幼蟲主要取食老葉表皮及葉肉，并在體周構造出絲和糞便的甬道，用以躲避天敵、不良環(huán)境等(陸永躍和王敏，2013)。其強大的繁殖能力及防治的困難性，導致在海南等地區(qū)省仍屬高度危險有害生物(閻偉等，2013)。

目前，對于椰子織蛾的研究主要集中在生物學和生態(tài)學、生物防治等方面(呂寶乾等，2018；吳琦琦等，2018)，在腸道微生物方面卻少有研究。昆蟲腸道系統是伴隨取食、消化、排泄等活動而多變的環(huán)境，其微生物種類豐富多樣。微生物在食物消化、生長發(fā)育、免疫及抵御病原菌方面起著重要作用(梅承等，2018；王四寶和曲爽，2017；Maurice & Navodita，2018；Crottietal.，2012)，一定意義上影響著昆蟲能否在一個地方快速適應、生存并入侵。基于微生態(tài)理論，昆蟲缺乏完整的酶系統，需要腸道微生物為食物消化、營養(yǎng)吸收和生物代謝提供不同種類的酶(Gandotraetal.，2012)。如夏曉峰(2014)對小菜蛾Plutellaxylostella(L.)中腸道微生物對纖維素的降解實驗發(fā)現，小菜蛾腸道細菌具有完整的纖維素和果膠降解酶基因，能協助宿主降解植物細胞壁中的纖維素、木聚糖和果膠等難降解物質。纖維素是一種豐富的碳源，以結晶或無定形的微纖維形式存在于植物的細胞壁中，不容易被宿主吸收，而許多植食性昆蟲的腸道微生物可以參與纖維素的降解(李丹紅等，2017；孫博通等，2017；Chakrabortyetal.,2000)。椰樹老葉相對新葉含有更多的纖維素，不容易被昆蟲消化利用。椰子織蛾在長期進化過程中，能夠很好地取食利用椰樹等老葉，表明其腸道可能含有降解纖維素的微生物。本文利用傳統生物分離純化培養(yǎng)方法，研究可培養(yǎng)腸道細菌的種類鑒定及其對纖維素、果膠、木聚糖等降解能力的分析，以期為后續(xù)深入研究椰子織蛾腸道微生物與宿主的相互作用及相關微生物資源的開發(fā)提供基礎。

1 材料與方法

1.1 椰子織蛾的飼養(yǎng)

椰子織蛾(采集于海南省儋州市)置于實驗室人工氣候箱(A1000, Conviron, Manitoba, Canada)中，飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃，RH為(75±10)%，于養(yǎng)蟲盒(25 cm×14 cm×7 cm，盒蓋封有48 μm紗網)中飼養(yǎng)2代。

1.2 椰子織蛾腸道的提取

取健康5齡幼蟲提前饑餓24 h，排空體內食物殘渣。于無菌操作臺中，先用無菌水擦拭清潔幼蟲表體，用75%酒精浸泡30 s做表體消毒后，用無菌水漂洗3次。在無菌條件下，用解剖針解剖蟲體，取其腸道，去除其他雜質，并放入0.9%生理鹽水中漂洗3次，再加入1 mL無菌水研磨成勻漿，備用。

1.3 椰子織蛾腸道細菌的分離純化

將上述提取的腸道勻漿在無菌條件下按10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12梯度稀釋。各取0.1 mL稀釋液在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g·L-1、酵母粉提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、瓊脂15 g·L-1、pH=7)上進行涂布，再將平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,每24 h觀察一次。根據菌落的顏色、大小和形態(tài)挑選不同的菌落在新的LB平板上用接種環(huán)劃線純化培養(yǎng)，每個菌落在平板上至少純化5次，得到單克隆菌株，純化得到的菌株接種至斜面培養(yǎng)基，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 椰子織蛾分離細菌16S rRNA的擴增

將分離純化得到的細菌樣本送至青島派森諾基因生物技術有限公司進行PCR擴增及DNA測序。細菌PCR擴增引物為16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。PCR反應體系：基因組DNA(20 ng·μL-1)1.0 μL、10×Buffer(含2.5 mg·mol-1Mg2+)5.0 μL、Taq聚合酶(5 U·μL-1)1.0 μL、dNTP(10 mg·mol-1)1.0 μL、27F引物(10 μg·mol-1)1.5 μL、1492R引物(10 μg·mol-1)1.5 μL、ddH2O 39.0 μL。反應條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，90 s；72 ℃，7 min，進行35個循環(huán)。反應完成后，取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR擴增片段。取各個菌種純化后的PCR產物，使用測序儀ABI3730-XL進行DNA測序。

1.5 椰子織蛾腸道細菌的菌種測定和系統發(fā)育分析

用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI(16s數據庫)中的數據進行比對，得到與待測物種序列相似性最大的物種信息，確定菌種鑒定結果。并采用革蘭氏染色制片的方法于光學顯微鏡下觀察獲取其顯微形態(tài)。

選取單克隆菌株的近緣序列，利用MEGA7.0軟件以鄰位相連算法(neighbor-joining)構建系統進化樹。

1.6 椰子織蛾腸道可培養(yǎng)細菌對纖維素、果膠及木聚糖的降解功能分析

(1)將分離純化得到的菌株分別接到纖維素篩選平板(羧甲基纖維素鈉10 g·L-1，蛋白胨1 g·L-1，(NH4)2SO24 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.4 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)、木聚糖篩選平板(木聚糖8 g·L-1，酵母粉1 g·L-1，(NH4)2SO24 g，K2HPO42 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)、果膠素篩選平板(果膠粉10 g·L-1，酵母粉1 g·L-1，(NH4)2SO24 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.4 g·L-1，FeSO40.01 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)上。將各平板倒置于恒溫箱培養(yǎng)，30 ℃，培養(yǎng)72 h。

(2)將能在上述平板上生長的菌株分別接至纖維素酶鑒定平板(羧甲基纖維素鈉5 g·L-1，(NH4)2SO22 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，CaCl20.1 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)、木聚糖酶鑒定平板(木聚糖5 g·L-1，(NH4)2SO22 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)、果膠酶鑒定平板(果膠粉5 g·L-1，(NH4)2SO22 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，NaNO33 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1，FeSO40.01 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，pH=7.0)上。將各平板置于恒溫箱培養(yǎng)，30 ℃，培養(yǎng)7 d，采用透明圈法對相關酶的產生菌進行鑒定。

纖維素酶產生菌的鑒定：在長出菌落的纖維素酶鑒定平板上，加入適量的0.1%剛果紅溶液染色10 min后，以1 mol·L-1NaCl脫色5 min, 觀察菌落周圍是否產生透明圈(背景為紅色)；木聚糖酶產生菌的鑒定：在長出菌落的木聚糖酶鑒定平板上，加入適量的盧戈碘液染色5 min后，觀察菌落周圍是否產生透明圈(背景為紫色)。果膠酶產生菌的鑒定：在長出菌落的果膠酶鑒定平板上，加入適量的0.1%溴酚藍染色5 min后，觀察菌落周圍是否產生黃色透明圈(背景為褐色)。

2 結果與分析

2.1 腸道細菌分離純化及基因測序

將椰子織蛾的腸道內容物按一定濃度涂布在LB培養(yǎng)基上，獲得腸道原始菌株。分別從上述培養(yǎng)基中挑選形態(tài)、大小、顏色不一的菌落進行分離純化，共得到待測的細菌菌落。將所得菌落進行DNA提取，以提取的基因為模版擴增并進行測序，用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI 16S數據庫中的數據進行比對。結果顯示，分離后的可培養(yǎng)菌株主要為高雄假黃單胞菌Pseudoxanthomonaskaohsiungensis(NR_043070.1)(99.71%)、伯克霍爾德氏菌Burkholderialata(NR_102890.1)(99.74%)、蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus(NR_115714.1)(99.73%)、沙福芽孢桿菌Bacillussafensis(NR_113945.1)(100%)、解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens(NR_116022.1)(100.00%)、貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis(NR_075005.2)(98.44%)、山羊葡萄球菌Staphylococcuscaprae(NR_119252.1)(99.93%)、寒氣玫瑰單胞菌Roseomonasaerofrigidensis(NR_158137.1)(98.84%)、微桿菌Microbacteriumesteraromaticum(NR_026468.1)(99.20%)9種菌株。

2.2 菌株的顯微形態(tài)

對以上菌株采用革蘭氏染色制片，在顯微鏡下觀察并獲得其顯微形態(tài)(圖1)，高雄假黃單胞菌、伯克霍爾德氏菌、寒氣玫瑰單胞菌革蘭氏染色呈紅色,為革蘭氏陰性菌株，其余均為紫色革蘭氏陽性菌株；顯微形態(tài)下可知，除山羊葡萄球菌為球狀結構外,其余均為桿狀結構，其中高雄假黃單胞菌呈微彎曲桿狀，微桿菌在培養(yǎng)后期呈桿狀球狀相間。

圖1 菌株的顯微形態(tài)

2.3 椰心葉甲、椰子織蛾腸道微生物組間豐度差異顯著性檢驗

將測序比對得到的上述菌株的16S rDNA序列進行系統進化分析(圖2),結果顯示,椰子織蛾腸道可分離培養(yǎng)細菌在進化樹上形成不同分支。其中，高雄假黃單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬于變形菌門Proteobacteria分支，假黃單胞菌為γ-變形菌綱，伯克霍爾德氏菌屬于β-變形菌綱。蠟樣芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、山羊葡萄球菌則組成了厚壁菌門Phylum Firmicutes的分支。微桿菌則屬于放線菌門Actinobacteria。

圖2 椰子織蛾幼蟲腸道可培養(yǎng)細菌16S rDNA系統發(fā)育分析

2.4 椰子織蛾腸道細菌功能分析結果

實驗結果表明,有4種菌株對纖維素具有降解能力，分別為伯克霍爾德氏菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌(圖3)。各菌株都不具備降解果膠的能力或暫未在可培養(yǎng)菌株中發(fā)現。有2種菌株具有降解木聚糖的能力，分別為寒氣玫瑰單胞菌和解淀粉芽孢桿菌(圖4)。其中，解淀粉芽孢桿菌既具有降解纖維素的能力也有降解木聚糖的能力。

圖3 椰子織蛾腸道細菌菌株對纖維素降解能力

圖4 椰子織蛾腸道細菌菌株對木聚糖降解能力

3 討論

本文分離培養(yǎng)鑒定得到的9株細菌與近年來研究所得可分離培養(yǎng)的昆蟲腸道微生物細菌大致一致，分別屬于常見的厚壁菌門(6種)、變形菌門(2種)和放線菌門(1種)，也正表明厚壁菌門和變形菌門為許多昆蟲腸道微生物中的優(yōu)勢種(藍波妙,2016; 劉小改等,2016; 楊焊,2012)。

前人研究表明，昆蟲腸道微生物對昆蟲取食消化、營養(yǎng)利用等方面的影響較大，如木食性白蟻和蟑螂后腸的共生微生物幫助宿主固氮、轉化含氮廢棄物尿酸為可利用的氮源，參與纖維素的降解等(Brune,2014)。纖維素、半纖維素等高產高效降解菌株的尋找與研究一直是科研的熱點，纖維素降解菌株在農業(yè)、能源、環(huán)保等多個領域發(fā)揮著巨大的作用。昆蟲已經進化出內源性和共生酶，以有效利用木質纖維素材料作為代謝葡萄糖的來源(Willisetal.,2010)。纖維素是世界上豐富的可再生資源，但對其利用及能源轉化一直未能得到很好解決，纖維素降解酶的活性低及成本高等問題限制著其工業(yè)生產。劉松等(2017)通過對竹蟲OmphisafuscidentalisHampson腸道微生物代謝通路分析及對纖維素降解酶菌株的分離來創(chuàng)造更多的纖維素分解生物資源，張科等(2020)從蟋蟀后腸中分離出多株纖維素降解細菌。本文所研究的椰子織蛾主要取食棕櫚科植物老葉，其葉片中纖維素、木聚糖等難降解物質占比高，而腸道微生物則一定程度上與降解這些物質相關。因而本實驗從椰子織蛾腸道中分離培養(yǎng)出多株具有降解纖維素或木聚糖能力的菌株，表明腸道細菌在昆蟲取食消化上的作用。

實驗結果可知，不同菌株降解透明圈有一定差異，采用基礎的透明圈與菌株菌落直徑比較的方法來判斷降解能力，其中，貝萊斯芽孢桿菌降解纖維素的能力顯著較強，解淀粉芽孢桿菌對木聚糖的降解情況良好并且同時能降解纖維素，這與郭天凱(2019)等從柞蠶AnthereapernyiGuerin-Meneville腸道菌中篩選鑒定出產纖維素酶活性較高的菌株屬于解淀粉酶芽孢桿菌屬相符。本實驗中所得到的具纖維素降解酶菌株的大量生產及降解活性的測定則希望能通過后續(xù)實驗解決。

本文利用傳統微生物培養(yǎng)與分離的方法對椰子織蛾幼蟲腸道細菌進行培養(yǎng)和分離。微生物能做到傳統分離培養(yǎng)，但傳統的培養(yǎng)方法和技術在一定意義上無法滿足微生物在自然生態(tài)條件下對環(huán)境因子、營養(yǎng)要素和物種間相互作用等方面的要求(袁志輝等,2014)，尤其是對與動植物之間具有復雜共生關系的微生物則更加困難(Westetal.,2007)。由于對大多數微生物與椰子織蛾腸道之間的共生機制的認識不足，無法模擬其共生環(huán)境的自然因素，導致很多微生物沒有被分離培養(yǎng)出來。通過對比可發(fā)現，目前的可培養(yǎng)菌株僅是其腸道內微生物的極小部分，后續(xù)研究可通過繼續(xù)尋找、優(yōu)化培養(yǎng)方法來發(fā)現其更多的可培養(yǎng)菌株,也可通過宏基因組分析等方法獲得更全面的腸道微生物組成。