肖 琳， 吳安寧， 許國(guó)超， 韓瑞枝， 倪 曄*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

惡臭假單胞菌廣泛分布于自然界中，常被用來(lái)降解環(huán)境中的一些有機(jī)溶劑，如對(duì)硝基苯酚、水楊酸、烷烴等。劉忠等分離到一株合成L-半胱氨酸的惡臭假單胞菌[1]，廣東省農(nóng)科院土壤肥料研究所解開(kāi)治等人發(fā)現(xiàn)一株能高效降解擬除蟲(chóng)菊酯的惡臭假單胞菌XP12[2]，這在生物農(nóng)藥領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。然而，當(dāng)有機(jī)溶劑含量較高時(shí)，菌體本身的存活率就會(huì)下降，進(jìn)而導(dǎo)致生物降解及生物合成的功能受到影響。目前，有關(guān)惡臭假單胞菌有機(jī)溶劑耐受性元件及改造方面的研究較少[3-4]。作者通過(guò)ARTP誘變技術(shù)對(duì)惡臭假單胞菌進(jìn)行隨機(jī)誘變，在高正丁醇?jí)毫ο逻M(jìn)行馴化培養(yǎng)，定向篩選高正丁醇耐受性菌株。

ARTP誘變育種[4]是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的育種技術(shù)，它受到射頻功率的驅(qū)動(dòng)，可以產(chǎn)生等離子射流，進(jìn)而影響細(xì)胞壁和質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和滲透性，導(dǎo)致DNA損傷，包括錯(cuò)義突變，缺失或移碼突變[5-8]。由于A(yíng)RTP技術(shù)具有活性粒子濃度高、操作容易、運(yùn)行成本低廉、安全性好，正突變率高以及對(duì)環(huán)境無(wú)污染等特點(diǎn)[9]，在微生物突變育種及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。南京工業(yè)大學(xué)姜岷團(tuán)隊(duì)利用ARTP誘變策略將大腸桿菌AFP111中木糖轉(zhuǎn)化為琥珀酸代謝途徑的關(guān)鍵物質(zhì)ATP的濃度提高了1.33倍[10]；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)趙耕毛團(tuán)隊(duì)通過(guò)ARTP技術(shù)培育Arthrobactersp.KQ11突變體，使其葡聚糖酶活性明顯增加[11]；成都大學(xué)田敏團(tuán)隊(duì)通過(guò)ARTP誘變獲得一株達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株[12]。

基因組重測(cè)序是高通量測(cè)序的一種重要應(yīng)用，通過(guò)對(duì)基因組序列已知的個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序[13]，并在個(gè)體或者群體水平上進(jìn)行差異性研究。日本學(xué)者Kamada等同時(shí)利用第三代測(cè)序儀PacBio RS sequencer和第二代測(cè)序儀Illumina MiSeq對(duì)納豆枯草芽孢桿菌進(jìn)行高通量測(cè)序和比較基因組研究，得到一個(gè)更為完整和高質(zhì)量的全基因組序列，填補(bǔ)了之前對(duì)該菌株測(cè)序的空白，并發(fā)現(xiàn)了330個(gè)新的蛋白質(zhì)編碼序列[14-15]；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院朱振東團(tuán)隊(duì)通過(guò)基因組重測(cè)序鑒定候選基因，并為大豆中的新型疫霉菌抗性基因RpsHC18開(kāi)發(fā)診斷標(biāo)記[16]。以上結(jié)果表明，新一代測(cè)序是一種精確、快速且經(jīng)濟(jì)有效的研究動(dòng)植物和微生物多樣性的重要手段。因此，作者通過(guò)對(duì)ARTP隨機(jī)誘變并馴化獲得的高正丁醇耐受性惡臭假單胞菌進(jìn)行全基因組重測(cè)序，根據(jù)測(cè)序所得的SNV和Indels分布進(jìn)行KEGG/GO注釋并分析，為進(jìn)一步研究其溶劑耐受性提供了理論依據(jù)。

正丁醇是一種較常見(jiàn)的短鏈醇類(lèi)有機(jī)物，其用途非常廣泛，主要用于生產(chǎn)酯類(lèi)衍生物，如：鄰苯二甲酸正丁酯、丙烯酸丁酯及醋酸丁酯等；此外，正丁醇還是一種極具潛力的新型生物燃料。目前，已有許多關(guān)于丙酮丁醇梭菌、大腸桿菌等微生物菌株正丁醇耐受性的研究報(bào)道，而對(duì)于惡臭假單胞菌的正丁醇耐受性的研究較少。宋亮[17-18]等通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了惡臭假單胞菌中3-羥基異丁酸脫氫酶、異分支酸水解酶超家族、蛋白延伸因子EF-Ts對(duì)大腸桿菌有機(jī)溶劑耐受性影響較大；錢(qián)曉紅[19]等通過(guò)構(gòu)建全局轉(zhuǎn)錄因子突變庫(kù)，最終篩選到兩株高有機(jī)溶劑耐受菌；張法[20]等篩選到一株耐受更高正丁醇和環(huán)己烷的突變株，并通過(guò)基因敲除發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌有機(jī)溶劑耐受性影響較大的兩個(gè)基因；司海明[21]等通過(guò)基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一系列與大腸桿菌有機(jī)溶劑耐受性相關(guān)的關(guān)鍵基因；吳安寧[22]等從分子伴侶出發(fā)，發(fā)現(xiàn)secB及其突變體T10A可顯著提高大腸桿菌正丁醇耐受性。作者旨在對(duì)馴化獲得的惡臭假單胞菌菌株進(jìn)行基因組重測(cè)序，挖掘與正丁醇耐受性相關(guān)的元件，為構(gòu)建正丁醇耐受性宿主菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)條件及馴化實(shí)驗(yàn)方法

菌株：P.putida901，作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。培養(yǎng)于固體或液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉浸膏3 g/L）中。誘變后的菌株在涂板后用液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基從固體平板上洗脫至液體搖瓶（50 mL）中，振蕩培養(yǎng)6 h后加入正丁醇，繼續(xù)培養(yǎng)18 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)接傳代，最后通過(guò)計(jì)算它們的比生長(zhǎng)速率對(duì)最終的馴化菌株進(jìn)行耐受性比較。

1.2 ARTP隨機(jī)誘變方法

采用思清源生物科技公司的常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)中以時(shí)間為可變參數(shù)，設(shè)定功率為100 W[1-4]。P.putida901菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次后稀釋至A600nm為0.5～0.7之間，取10μL該稀釋菌液滴在載片上，涂布均勻，將它們分別暴露在A(yíng)RTP粒子流下10、15、20、35 s，處理過(guò)后的載片轉(zhuǎn)移至含有1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的EP管中于30℃和120 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，之后將培養(yǎng)液稀釋102，103，104倍，取50μL涂布于固體平板上（每個(gè)稀釋樣品做3次平行涂布），在30℃培養(yǎng)24 h。

1.3 全基因組重測(cè)序方案

利用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組重測(cè)序，根據(jù)制造商所給方案進(jìn)行二代測(cè)序樣品庫(kù)的構(gòu)建，首先將基因組DNA隨機(jī)切割成500 bp的小片段，用End Prep Enzyme Mix處理片段進(jìn)行末端修復(fù)，使其在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行5′磷酸化和dA-加尾，最后通過(guò)T-A連接來(lái)在兩端添加銜接子。使用AxyPrep Mag PCR Clean-up（Axygen）對(duì)銜接子修飾后的DNA片段進(jìn)行分離純化，從中回收長(zhǎng)度約410 bp的片段（具有約350 bp的插入片段）（見(jiàn)表1）。然后使用P5和P7引物對(duì)每個(gè)樣品擴(kuò)增8個(gè)循環(huán)，因?yàn)閮蓚€(gè)引物都攜帶可以進(jìn)行橋式PCR的序列，并且P7引物還攜帶堿基標(biāo)簽，故可以多路復(fù)用。使用AxyPrep Mag PCR Clean-up純化PCR產(chǎn)物，通過(guò)Agilent 2100生物分析儀對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，并通過(guò)Qubit2.0熒光計(jì)進(jìn)行定量。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)將具有不同索引的文庫(kù)多路復(fù)用并加載到Illumina HiSeq儀器上。使用2×150雙端配置進(jìn)行測(cè)序，圖像分析和堿基調(diào)用則由HiSeq儀器上的HiSeq控制軟件進(jìn)行。

表1 測(cè)序方案Table 1 The Sequencing protocol

1.4 全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件及方法

數(shù)據(jù)過(guò)濾可以去除原始數(shù)據(jù)中帶有的接頭和低 質(zhì) 量 的reads， 對(duì) 于 所 有 原 始reads， 使 用Cutadapt1.9.1去除銜接子的序列、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物序列等，使用BWA0.7.12將干凈數(shù)據(jù)繪制到參考基因組，使用PicardV1.119刪除重復(fù)的映射結(jié)果，SNV/InDel的注釋則是由Annovar完成，Pindel和CNVnator用于進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)變異分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 高正丁醇耐受性突變體的馴化篩選

為篩選高正丁醇耐受性突變體，利用ARTP誘變育種技術(shù)對(duì)菌株P(guān).putida901進(jìn)行隨機(jī)誘變和正丁醇馴化培養(yǎng)。

首先考察了不同ARTP照射時(shí)間與P.putida901致死率的關(guān)系曲線(xiàn)（見(jiàn)圖1）。圖中在15 s誘變時(shí)間下，致死率為81.7%，10 s誘變時(shí)間下致死率為54.3%，均處于合理水平，因此選用10 s和15 s的照射時(shí)間進(jìn)行誘變處理。在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，正丁醇添加的初始質(zhì)量濃度為4 g/L，并以質(zhì)量濃度為0.8 g/L的梯度逐漸增加，每個(gè)質(zhì)量濃度下進(jìn)行5輪轉(zhuǎn)接，最終在10 s誘變條件下獲得耐受12 g/L質(zhì)量濃度的正丁醇的突變株。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在9.6 g/L質(zhì)量濃度的正丁醇下，突變株對(duì)正丁醇耐受性提高了約兩倍（見(jiàn)圖2）。對(duì)于15 s誘變時(shí)間，在正丁醇質(zhì)量濃度增加到9.6 g/L時(shí)突變體正丁醇耐受性效果反而變差，推測(cè)可能是由于該條件下突變率和負(fù)突變?cè)龆?，?dǎo)致致死率增加。隨后，對(duì)未經(jīng)任何馴化的惡臭假單胞菌（WT）、經(jīng)正丁醇馴化后的惡臭假單胞菌（WTn-butanol）以及經(jīng)ARTP技術(shù)誘變并馴化后的惡臭假單胞菌（ARTP10S）進(jìn)行基因組重測(cè)序。

圖1 不同ARTP誘變處理時(shí)間下P.putida 901的致死率Fig.1 Mortality rate of P.putida 901 under different ARTP mutagenesis time

圖2 對(duì)照（WT）與經(jīng)誘變馴化后菌株的比生長(zhǎng)速率Fig.2 Specific growth rate of control strain（WT）and adapted strain

2.2 突變體的基因組重測(cè)序結(jié)果和分析

為探究突變株與野生型菌株之間的差異，利用第二代測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建插入片段長(zhǎng)度為350 bp的文庫(kù)，采用測(cè)序平臺(tái)Illumina HiSeq對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)參考基因組比對(duì)結(jié)果進(jìn)行注釋?zhuān)玫奖?中的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示3個(gè)測(cè)序樣本之間WTn-butanol的PF數(shù)據(jù)（pass filtering data）和干凈數(shù)據(jù)（Clean data）與其他兩個(gè)樣本的數(shù)據(jù)量差異較大，因?yàn)楦蓛魯?shù)據(jù)是在PF數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步刪除質(zhì)量不好的reads后得到的數(shù)據(jù)，這說(shuō)明測(cè)序過(guò)程中WTn-butanol樣本測(cè)序所得到的質(zhì)量不好的reads數(shù)較少，因此其干凈數(shù)據(jù)與其他兩者相差較大。而所有樣品的SNV和Indels數(shù)相差在15～50個(gè)之間，這表明相對(duì)于參考基因組來(lái)說(shuō)，3個(gè)樣品各自都有特異的突變，同時(shí)還可能有共同的突變。

表2 測(cè)序結(jié)果中的SNV和Indel數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 SNV and Indel statistics in sequencing results

此外，根據(jù)物種的已知基因，將物種的基因組劃分為不同的功能單位，然后依據(jù)突變所發(fā)生的位置，將每個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行功能區(qū)域分類(lèi)，并對(duì)各樣本所檢測(cè)到的突變位點(diǎn)依據(jù)功能區(qū)進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。從表3發(fā)現(xiàn)，大部分突變位點(diǎn)分布在基因的外顯子區(qū)，即CDS區(qū)或者mRNA區(qū)，而 在ncRNA區(qū)、3'UTR區(qū)及一些剪切位點(diǎn)區(qū)域的突變個(gè)數(shù)是0，這說(shuō)明突變發(fā)生在基因編碼區(qū)中比較多，在非編碼區(qū)突變很少，一方面可能是因?yàn)檫@些區(qū)域在基因組上所占比例較小，發(fā)生突變的概率較??；另一方面可能是因?yàn)橥蛔儼l(fā)生在這些區(qū)域會(huì)影響到不同RNA之間的結(jié)合，因?yàn)橥蛔兾稽c(diǎn)若位于mRNA 3′UTR區(qū)，會(huì)影響microRNA對(duì)其結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解受阻，mRNA表達(dá)會(huì)上升，進(jìn)而影響到一些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，如與耐受性相關(guān)的外排泵蛋白及其他的膜蛋白。

表3 SNV/Indels在基因組不同功能區(qū)域的分布狀況Table 3 Distribution of SNV/Indels in different functional regions of the genome

接著，對(duì)各個(gè)樣本之間進(jìn)行分組（WT/ARTP10S、WT/WTn-butanol、ARTP10S/WTn-butanol）和比較基因組學(xué)研究，以期獲得它們之間共有和特有的突變數(shù)目（見(jiàn)圖3）。分析發(fā)現(xiàn)它們彼此之間相對(duì)于參考基因組來(lái)說(shuō)，共有突變基因數(shù)目相近（均為41 000左右），其中最多的是WT，并通過(guò)兩兩之間的比較發(fā)現(xiàn)它們的特有突變基因數(shù)目相差至少有1 100個(gè)。在WT/WTn-butanol分組中，WT的特有突變占總突變數(shù)的3.7%，WTn-butanol的特有突變比例為3.0%；而在WT/ARTP10S分 組 中，WT的 特 有 突 變WTn-butanol的特有突變比例為2.9%，ARTP10S特有突變比例為2.7%；在WTn-butanol/ARTP10S分組中，ARTP10S的特有突變比例為3.3%，WTn-butanol的特有突變比例為2.7%，這說(shuō)明在同樣的正丁醇脅迫條件下，經(jīng)過(guò)ARTP誘變系統(tǒng)處理過(guò)的菌株的突變個(gè)數(shù)多于未經(jīng)誘 變 的菌株。 而相對(duì) 于WT來(lái)說(shuō)，WTn-butanol和ARTP10S兩者之間的特有突變差異為0.3%，這些結(jié)果說(shuō)明ARTP誘變技術(shù)及正丁醇馴化都不同程度地對(duì)基因組序列突變產(chǎn)生了特有的影響，并且正是由于這些差異的突變而導(dǎo)致細(xì)胞的耐受性產(chǎn)生變化，后期將對(duì)這些差異突變進(jìn)行更深層次的研究，以期獲得更多參與正丁醇耐受性相關(guān)的細(xì)胞元件。

圖3 不同樣本中突變基因的Venn圖分布狀況Fig.3 Venn plot of mutations in different samples

2.3 基因組重測(cè)序結(jié)果的功能注釋

根據(jù)總的Indels分布情況（見(jiàn)圖4）發(fā)現(xiàn)Indels長(zhǎng)度集中分布在1～50 bp區(qū)域，并且數(shù)量最多的還是1 bp大小的片段插入，且隨著插入片段越長(zhǎng)，Indels數(shù)目也越來(lái)越少。相對(duì)于參考基因組來(lái)說(shuō)，樣本W(wǎng)Tn-butanolIndels數(shù)目最多（2 205個(gè)），其次是WT（2 171個(gè)），最少的是ARTP10S（2 153個(gè)），這與圖3反映的結(jié)果一致。上述結(jié)果說(shuō)明ARTP處理10 s并沒(méi)有引起基因序列的大面積缺失或者插入，僅僅是一些小片段的插入或者缺失，通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Indels插入位置在treZ、fimV、LOR等基因上，其中treZ基因所編碼的麥芽糖寡糖基海藻糖水解酶能夠水解海藻糖，而海藻糖是能夠穩(wěn)定生物膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，破壞其水解酶基因能夠提高海藻糖的含量，進(jìn)而穩(wěn)定細(xì)胞生物膜，提高細(xì)胞的耐受性；fimV基因編碼細(xì)胞運(yùn)動(dòng)蛋白，LOR基因編碼細(xì)胞膜組件蛋白，這與細(xì)胞的生理性應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。

圖4 不同樣本Indel的長(zhǎng)度分布狀況Fig.4 Distribution of Indel length

將測(cè)序結(jié)果中的SNV及Indels使用GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本體功能分析，同時(shí)通過(guò)在線(xiàn)軟件鏈接KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序樣本分組的SNV/Indels進(jìn)行信號(hào)通路分析。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋發(fā)現(xiàn)其含有人類(lèi)疾病、有機(jī)體系、代謝、細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境應(yīng)激、遺傳信息處理等6個(gè)功能大類(lèi)，每一大類(lèi)中又可以分為不同的代謝功能類(lèi)別，共有59條代謝通路。分別 統(tǒng) 計(jì) 了WT/ARTP10S、WT/WTn-butanol、ARTP10S/WTn-butanol之間所有突變基因的功能，重點(diǎn)比較了WT/ARTP10S的注釋結(jié)果，發(fā)現(xiàn)最多的共有突變主要涉及代謝相關(guān)的基因，占總突變的98.6%（見(jiàn)圖5），而這一大類(lèi)中數(shù)目最多的是氨基酸代謝相關(guān)的基因突變，占14.2%的比例，其次是糖代謝相關(guān)，占比12.2%，說(shuō)明正丁醇脅迫下惡臭假單胞菌細(xì)胞中糖代謝、氨基酸代謝相關(guān)物質(zhì)含量發(fā)生了改變，正丁醇脅迫下菌株的糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)可能被抑制，氨基酸代謝和糖代謝相關(guān)基因的突變使細(xì)胞內(nèi)有足夠的能量供應(yīng)，維持細(xì)胞生長(zhǎng)，以抵抗外界不利因素，使其更進(jìn)一步適應(yīng)正丁醇環(huán)境，進(jìn)而提高耐受性。同時(shí)比較了WT/ARTP10S突變之間的差異基因注釋結(jié)果，從圖6可以看到，突變總數(shù)目最多的依然是代謝類(lèi)相關(guān)基因，占比為78.6%。突變差異數(shù)目最多的基因是環(huán)境應(yīng)激大類(lèi)中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，占總差異突變數(shù)的14.3%。由于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與細(xì)胞耐受性緊密聯(lián)系，當(dāng)環(huán)境中正丁醇進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制時(shí)，細(xì)胞則通過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將正丁醇排出細(xì)胞外，進(jìn)而提高其自身的正丁醇耐受性。根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有突變涉及分子功能、細(xì)胞組件、生物學(xué)過(guò)程等多種生理代謝工程。通過(guò)統(tǒng)計(jì)WT/ARTP10S這一組的結(jié)果（圖7），發(fā)現(xiàn)其中涉及分子功能的比例是44.2%，其突變基因數(shù)目從高到低依次為催化活力、結(jié)合相關(guān)基因、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活力、轉(zhuǎn)運(yùn)活力、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活力、電子載體活力、抗氧化活力與蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活力、結(jié)構(gòu)分子活力相關(guān)基因。涉及生物過(guò)程的基因比例是48.2%，其突變數(shù)目從高到低依次是代謝過(guò)程、細(xì)胞的過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、單一的生物過(guò)程、定位、運(yùn)動(dòng)、再生相關(guān)基因。而細(xì)胞組分這一類(lèi)比例較少，為7.6%，它的基因突變數(shù)目從高到低依次是細(xì)胞組分、膜組分、膜、大分子復(fù)合物、細(xì)胞器組分及擬核相關(guān)基因。綜上，三大類(lèi)功能中基因突變數(shù)較多的有蛋白或者膜結(jié)合相關(guān)的基因、代謝過(guò)程相關(guān)基因及膜轉(zhuǎn)運(yùn)和膜組分相關(guān)基因，而這些基因與細(xì)胞的正丁醇耐受性緊密聯(lián)系，各司其職。首先，膜組分相關(guān)基因合成的細(xì)胞膜能夠阻擋正丁醇進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生防護(hù)的第一道屏障；其次，進(jìn)入細(xì)胞的正丁醇，可通過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將其輸送至細(xì)胞外；最后，若膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被破壞，細(xì)胞可通過(guò)自身的糖代謝、氨基酸代謝相關(guān)基因的調(diào)節(jié)來(lái)抵抗環(huán)境中壓力。

圖5 WT/ARTP10S共有基因突變的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.5 KEGG database annotation results of WT/ARTP10S shared gene mutation

圖6 WT/ARTP10S差異突變基因的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.6 KEGG database annotation results of WT/ARTP10S differential gene mutation

圖7 WT/ARTP10S相對(duì)參考基因組的所有突變?cè)贕O數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.7 GO database annotation results of WT/ARTP10S mutant genes

3 結(jié)語(yǔ)

采用ARTP技術(shù)對(duì)P.putida901進(jìn)行隨機(jī)誘變和馴化篩選，使其對(duì)正丁醇的耐受質(zhì)量濃度從4 g/L提高至12 g/L。在9.6 g/L正丁醇質(zhì)量濃度下，突變株的比生長(zhǎng)速率提高了2倍以上。運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)經(jīng)過(guò)ARTP誘變后傳代馴化的惡臭假單胞菌進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)經(jīng)ARTP誘變后的樣本基因效果比野生型有所減少。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行代謝通路分析[23-25]，發(fā)現(xiàn)突變最多的是氨基酸等代謝相關(guān)基因。通過(guò)GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)突變基因進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)基因突變主要集中于分子功能相關(guān)、結(jié)合相關(guān)及擬核相關(guān)基因群[25-27]。本研究為惡臭假單胞菌的溶劑耐受性元件挖掘和菌株表型改造等研究提供了一定的依據(jù)。