張 紅，孫婷婷，劉 洋，薛敬冬，李粉萍，楊 琳

（1.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安710003；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安710003；3.陜西省楊凌示范區(qū)醫(yī)院藥劑科，陜西 咸陽712100）

肝纖維化是各種慢性肝炎發(fā)展為肝硬化前共有的可逆性病理組織學(xué)改變，若不給予有效的抗肝纖維化治療。丹桃養(yǎng)肝丸是陜西省中醫(yī)醫(yī)院國家名老中醫(yī)藥專家、陜西省名中醫(yī)成冬生主任醫(yī)師治療慢性乙型肝炎肝纖維化的經(jīng)驗(yàn)方。慢性乙型肝炎為正虛邪戀，正虛以氣虛為主，進(jìn)一步發(fā)展會(huì)出現(xiàn)血瘀等，氣虛而血瘀，而肝體陰而用陽，主藏血。丹桃養(yǎng)肝丸依據(jù)以活血化瘀為本、益氣養(yǎng)血柔肝兼重的防治肝纖維化理論基礎(chǔ)，治療慢性乙型肝炎肝纖維化，臨床療效顯著，為科室診療常規(guī)方案。為擴(kuò)大臨床使用范圍，使更多患者受益，擬將該方開發(fā)為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑。本研究中采用薄層色譜（TLC）法定性鑒別該制劑中的丹參、當(dāng)歸、黃芪3味藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法對方中君藥丹參的主要化學(xué)成分丹酚酸B進(jìn)行了含量測定，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供客觀的定性定量評價(jià)方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Secura125-1CN型電子分析天平（d=0.01 mg），Quintix244-1CN型電子分析天平（d=0.1 mg），均購自北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 試藥

丹桃養(yǎng)肝丸（醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為170801，170802，170803）；黃芪甲苷對照品（供含量測定用，批號(hào)為110781-201314），丹酚酸B對照品（供含量測定用，批號(hào)為111562-201313），丹參對照藥材（批號(hào)為120923-201414），均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；其他試劑均為分析純，均購自國藥集團(tuán)；丹參、當(dāng)歸、黃芪藥材購自陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所楊智峰研究員鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

丹參[1]：取樣品2 g，粉碎成細(xì)粉，置錐形瓶中，加2滴鹽酸和20 mL 70%甲醇，超聲處理15 min，離心取上清液，水浴蒸干，加甲醇1 mL溶解，制得供試品溶液。同法制備缺丹參的陰性對照品溶液。取丹參對照藥材1 g和丹酚酸B對照品，同法制得對照藥材溶液和對照品溶液（含丹酚酸B 0.5 mg/mL）。分別吸取上述4種溶液點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，點(diǎn)樣量為2μL，以丙酮-36%乙酸-濃氨（10∶25∶2，V/V/V）為展開劑，展開，在紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中檢出丹酚酸B及丹參，陰性對照無干擾。見圖1 A。

當(dāng)歸[2]：取樣品3g，粉碎成細(xì)粉，置錐形瓶中，加30mL乙醚，超聲提取10 min，濾過，揮干乙醚，加乙醇1 mL溶解，制得供試品溶液。同法制備缺當(dāng)歸的陰性對照品溶液及對照藥材溶液。分別取上述3種溶液各10μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1，V/V）為展開劑，展開，在紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中檢出當(dāng)歸，陰性對照無干擾。見圖1 B。

黃芪[3]：取樣品細(xì)粉7 g，置錐形瓶中，加甲醇50 mL，回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL溶解，用水飽和的正丁醇提取，提取液依次用1%NaOH溶液、水溶液洗滌2次，蒸干，加少量水溶解，加D101型大孔樹脂柱頂，依次以50 mL水、30 mL 40%乙醇洗脫雜質(zhì)，棄去，最后以50 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解，制得供試品溶液。同法制備缺黃芪的陰性對照品溶液。取黃芪甲苷對照品適量，加入甲醇，得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。分別吸取上述3種溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）的下層溶液為展開劑，展開，用10%硫酸乙醇溶液顯色，105℃加熱顯色。供試品溶液色譜中檢出黃芪甲苷，陰性對照無干擾。見圖1 C。

2.2 丹酚酸B含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色 譜 柱：M05CLA25 Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：286 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)應(yīng)大于6 000。

2.2.2 溶液制備

取樣品細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，超聲提取30 min，放冷，用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，作為供試品溶液，備用。

同法制備缺丹參的陰性對照品溶液[4-5]。精密稱取丹酚酸B 10.6 mg，溶于10 mL甲醇，得質(zhì)量濃度為0.106 mg/mL的對照品溶液，避光保存。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下3種溶液10μL，按擬訂色譜條件檢測。結(jié)果丹酚酸B色譜峰分離良好，陰性對照無干擾，色譜圖見圖2。

線性關(guān)系考察：精密量取丹酚酸B對照品溶液，置容量瓶中，用甲醇稀釋，得質(zhì)量濃度為0.005 3 mg/mL的溶液，精密吸取2，4，6，8，10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=21 838X-21 321，r=0.999 8。結(jié)果表明，丹酚酸B進(jìn)樣量在0.212～1.060μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：取丹酚酸B對照品溶液10μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果丹酚酸B峰面積的RSD為0.43%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果丹酚酸B含量的RSD為1.91%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為170801），依法制備供試品溶液，取10μL，于室溫下測定12 h內(nèi)的穩(wěn)定性（每隔2 h測定1次）。結(jié)果丹酚酸B峰面積的RSD為2.78%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（含量為7.604 9 mg/g）0.5 g，共9份，分別加入質(zhì)量濃度為0.524 mg/mL的丹酚酸B對照品溶液2，2，2，4，4，4，6，6，6 mL，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1丹酚酸B加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

取3批（批號(hào)分別為170801，170802，170803）樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果丹酚酸B含量分別為7.69，7.79，7.64 mg/g，平均含量為7.71 mg/g。

3 討論

3.1 定性鑒別中對照品選擇

丹參、當(dāng)歸和黃芪分別為方中君、臣、佐藥。丹參活血化瘀、養(yǎng)血止痛、涼血消腫，針對慢性乙型肝炎肝纖維化中醫(yī)證候瘀血阻絡(luò)之主證，為君藥；當(dāng)歸補(bǔ)血、活血、止痛，主治血虛諸證，瘕積聚、虛寒腹痛等，加強(qiáng)君藥活血化瘀，養(yǎng)血柔肝之功效，為臣藥；黃芪益氣養(yǎng)血，治療氣血兩虛之兼證，為佐藥[6]。丹參中主要有效成分為脂溶性的丹參酮類[7]和水溶性的丹酚酸B、丹參素等[8]。當(dāng)歸藥材中含有主要化學(xué)成分包括揮發(fā)性成分如藁本內(nèi)酯、苯乙酮、十二醇、庚烷、烷烴等，其他如阿魏酸、維生素類、尿嘧啶、腺嘌呤等[9]，其成分復(fù)雜，特征性成分不明顯。黃芪主要有效成分以黃芪甲苷為代表[10]。因此，以丹參及丹酚酸B為對照品鑒別丹參，以當(dāng)歸藥材為對照鑒別當(dāng)歸，以黃芪甲苷為對照品鑒別黃芪。所建立的方法可從丹桃養(yǎng)肝丸樣品中檢出丹參及丹酚酸B、當(dāng)歸、黃芪甲苷，陰性對照無干擾。

葉下珠為方中佐藥，味苦、性寒，歸肝經(jīng)，清熱利濕，解毒平肝，現(xiàn)代常用于慢性病毒性肝炎及肝纖維化的治療[11-12]。病毒性肝炎病因共識(shí)為濕熱疫毒為患，本方取其寒涼清利之性，直清肝經(jīng)濕熱，針對慢性乙型肝炎濕熱內(nèi)蘊(yùn)而設(shè)。葉下珠藥材中含有沒食子酸、甲氧基鞣花酸、柯里拉京等多種化學(xué)成分[13]。以葉下珠藥材為對照鑒別葉下珠，采用50%甲醇為提取溶劑，超聲提取，再用乙酸乙酯提取制備樣品溶液。曾選擇硅膠G薄層板，甲苯-三氯甲烷-丙酮-甲酸（8∶5∶7∶2，V/V/V/V）為展開劑；硅膠G薄層板，冰醋酸-乙醇-乙酸乙酯-甲酸（8∶6∶2∶0.5，V/V/V/V）為展開劑；硅膠GF254薄層板，三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸（3∶5∶1，V/V/V）為展開劑。結(jié)果或分離效果較差，或陰性對照有干擾，故未能建立葉下珠的薄層鑒別方法。

3.2 色譜條件選擇