周羅成， 王 寧， 朱瑩瑩， 張姣姣， 王海嶸， 康 健

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，上海 200096）

白念珠菌 （Candida albicans） 是真菌感染（fungal infection）較為常見的病原真菌之一，其治療常用到氟康唑等三唑類藥物[1]。近年來，由于大量使用三唑類藥物，白念珠菌對氟康唑耐藥性日益顯現(xiàn)。 我國研究顯示，白念珠菌血癥對氟康唑的耐藥率約為10%[2]， 上海長海醫(yī)院的一項研究顯示，2012—2014 年分離的1 764 株白念珠菌對氟康唑耐藥率為14.6%[3]。 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院2014 年檢測出白念珠菌約為12%[4]， 而其他一些地區(qū)的單中心研究耐藥情況更嚴(yán)重， 如杭州第三人民醫(yī)院為20.7%、河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院則是54.1%[5-6]。 故白念珠菌對氟康唑耐藥的產(chǎn)生機制研究已經(jīng)成為熱點。

造成白念珠菌對氟康唑耐藥的重要機制之一為白念珠菌體內(nèi)可產(chǎn)生外排泵蛋白，可以將真菌體內(nèi)的氟康唑泵出， 造成菌株體內(nèi)有效藥物濃度下降，從而導(dǎo)致對氟康唑耐藥[7]。與耐藥相關(guān)的外排泵蛋白主要有多藥耐藥 1 （multidrug resistance 1，MDR1） 基因轉(zhuǎn)錄的滲透性糖蛋白（permeability glycoprotein，Pgp） 及白念珠菌耐藥基因 1（Candida drug resistance 1，CDR1）、CDR2 轉(zhuǎn)錄的 Cdr1 蛋白（CDR protein 1，Cdr1）、Cdr2[8-9]。 有研究表明法尼醇是白念珠菌的群體感應(yīng)分子[10]，可競爭性抑制藥物外排蛋白的功能，并誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡。 另有學(xué)者構(gòu)建了Cdr1 蛋白高表達(dá)的白念株菌株， 發(fā)現(xiàn)法尼醇在白念珠菌細(xì)胞內(nèi)與谷胱甘肽結(jié)合成為法尼醇-谷胱甘肽結(jié)合物，后者被高表達(dá)的Cdr1 蛋白泵排出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽耗盡，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增高，最終導(dǎo)致真菌死亡[11]。 同時張曉云等[12]的研究表明MDR1 在氟康唑耐藥白念珠菌中也存在高表達(dá)。 據(jù)此推測，法尼醇可能會通過高表達(dá)MDR1 基因轉(zhuǎn)錄的Pgp，導(dǎo)致耐藥白念珠菌細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量減少， 細(xì)胞內(nèi)活性氧類（reactive oxygen species，ROS）積聚增多，胱天蛋白酶3（caspase 3）活性增加，由此導(dǎo)致耐藥白念珠菌細(xì)胞凋亡。

材料與方法

一、材料

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控株SC5314 由中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)提供。氟康唑購自上海信誼藥廠有限公司，胱天蛋白酶3 活性試劑盒及總谷胱甘肽試劑盒購自南京建成有限公司（貨號：G007）；酶標(biāo)儀購自 THERMO 公司（貨號：MK3）；還原型谷胱甘肽試劑盒(Glutathione Assay Kit)購自 Sigma 公司（貨號：CS0260）；PCR 引物由生工生物工程 （上海）有限公司合成。

二、濃度梯度法誘導(dǎo)氟康唑耐藥株

通過濃度梯度法獲得本研究所需的氟康唑誘導(dǎo)耐藥株。 將白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株在沙氏葡萄糖瓊脂（Sabouraud dextrose agar，SDA）培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h，后取單個菌落再次接種在SDA 培養(yǎng)基48 h 以保證菌株的活力及純度。后取單個白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌落轉(zhuǎn)種于未含有氟康唑藥物的SDA 培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)，從而制備成含菌培養(yǎng)液，使得菌液濃度為0.5 麥?zhǔn)蠁挝弧?離心后取菌懸液100 μL 分別涂布于含有不同倍數(shù)最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的氟康唑培養(yǎng)液中30℃培養(yǎng)，并分別測定實驗菌株對氟康唑的敏感性，最后達(dá)到氟康唑敏感株 MIC≤8 μg/mL，耐藥株 MIC≥64 μg/mL，符合美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推薦的 M27-A3 方 案判定標(biāo)準(zhǔn)，并-80℃保種[9]。

三、四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）比色法

氟康唑耐藥組及對照組的白念珠菌均處于對數(shù)生長狀態(tài)， 使用麥?zhǔn)媳葷岱ù_定真菌濃度為1×106～1×107菌落形成單位（colony forming unit，CFU）/mL。2 組中加入法尼醇， 并補充RPMI 1640 培養(yǎng)液使2 組菌液的法尼醇濃度統(tǒng)一為200 μmol/L，37℃孵育24 h。 用酶標(biāo)儀于570 nm 處以空白孔調(diào)零測各孔光密度值。

四、胱天蛋白酶3活性檢測

使用胱天蛋白酶3 活性測試盒測定細(xì)胞內(nèi)胱天蛋白酶3 活性。 對樣品離心， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，去上清，加裂解液冰浴裂解；后 4℃離心（12 000 轉(zhuǎn)/min，10～15 min）； 取樣加入 2×反應(yīng)液、裂解液及 5 μL Ac-DEVD-PNA，37 ℃孵育 4 h， 發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯，用酶標(biāo)儀在λ=405 nm 測定其吸光值A(chǔ)，計算誘導(dǎo)劑與陰性對照A 的比值以確定胱天蛋白酶3 的活性 （氟康唑耐藥組胱天蛋白酶活化程度值/對照組相應(yīng)值）。

五、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量測定

使用微量酶標(biāo)法測定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽以及氧化型谷胱甘肽含量。 細(xì)胞樣品用PBS 洗滌1 次，1 500 轉(zhuǎn)/min 離心，去上清液。按沉淀體積的3 倍體積加5%磺基水楊酸 （sulfosalicylic acid dihydrate，SSA）溶液，震蕩懸浮，凍融 2 次，12 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，取上清液。

在樣品上清液中加入還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotine adenine dinucleotide phosphate，NADPH），前、后 5 min 各于 412 nm 處讀值，計算ΔA412。 使用谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)溶液的值來確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算標(biāo)準(zhǔn)ΔA412/min，根據(jù)公式：每毫升樣本中的谷胱甘肽（nmol）=ΔA412/min（樣品）×樣本測試前稀釋倍數(shù)/ΔA412/min（標(biāo)準(zhǔn)）×樣品的體積ΔA412/min （1 nmol） 表示 1 nmol 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，從而計算出樣品中的谷胱甘肽含量。

使用總谷胱甘肽測定試劑盒（微板法）測定其含量。在樣品中加入測定盒試劑，并充分混勻，酶標(biāo)儀中 405 nm 處前、后 5 min 讀取 2 次數(shù)值 A1、A2并計算，ΔA=A2-A1，根據(jù)公式：總谷胱甘肽=ΔA（測定值）/ΔA（標(biāo)準(zhǔn)值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣品測試前稀釋倍數(shù)。

氧化型谷胱甘肽=總谷胱甘肽含量-谷胱甘肽含量。

六、細(xì)胞內(nèi)ROS檢測

用酶聯(lián)免疫吸附測定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試驗測定各組白念珠菌胞內(nèi)ROS 活性，對結(jié)果取相對值（耐藥組/對照組）并進行統(tǒng)計分析。 取ROS 活性檢測試劑二氯氫化熒光素二乙酸酯（dichlorofuorescin diacetate，DCFHDA）加入培養(yǎng)基，濃度為 10 μmol/L。 37℃孵育待檢測細(xì)胞60 min，并將收集好的細(xì)胞用PBS 重懸。 將DCFH-DA、待檢測細(xì)胞混合，酶標(biāo)儀測定，激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長525 nm。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

用SAS 軟件進行統(tǒng)計分析。 所有實驗均重復(fù)3 次，取均值。 計量資料以表示，采用 t 檢驗。 P＜0.05 表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、2組加入法尼醇后菌株增殖情況比較

MTT 法檢測顯示2 組菌株的增殖情況， 與0 h對比， 培養(yǎng)24 h 后對照組的細(xì)胞增殖率為0.86±0.05，而耐藥組為0.64±0.05。 法尼醇對耐藥組菌株的增殖抑制較對照組顯著（t=5.41，P=0.005 7）。

二、白念珠菌活化胱天蛋白酶-3的檢測

白念珠菌細(xì)胞內(nèi)胱天蛋白酶-3 活化程度相對值對照組為1.00±0.00，氟康唑耐藥組為1.84±0.70，氟康唑耐藥組胞內(nèi)胱天蛋白酶-3 活化程度明顯高于對照組（t=5.16，P=0.035 5）。

三、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量測定

白念珠菌胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的相對含量對照組為 1.00±0.00，氟康唑耐藥組為 0.63±0.17，2 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.27，P=0.011 4）。 白念珠菌胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽相對含量對照組為1.00±0.00，而氟康唑耐藥組為 0.32±0.10，2 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=28.13，P=0.001 3）。

四、ROS活性的測定

對照組中白念珠菌胞內(nèi)ROS 活性相對值為1.00±0.00，氟康唑耐藥組為 1.45±0.30，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.48，P=0.023 0）。

討 論

有文獻報道法尼醇可造成白念珠菌細(xì)胞凋亡，其機制之一為法尼醇可以在白念珠菌細(xì)胞內(nèi)與谷胱甘肽相結(jié)合，兩者形成的結(jié)合態(tài)被白念珠菌耐藥蛋白Cdr1 泵出菌株細(xì)胞外， 從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽減少， 細(xì)胞的抗氧化還原能力減弱，細(xì)胞死亡[12-13]。但其所用菌株為SC5314 標(biāo)準(zhǔn)菌株及CDR1 基因敲除或 CDR1 基因高表達(dá)的 CAI4、DSY449 菌株，且此類菌株均對氟康唑敏感，故不能由此推測法尼醇對氟康唑耐藥的白念珠菌具有同樣的殺滅作用。

通過濃度梯度法，本研究成功獲得了氟康唑耐藥的白念珠菌菌株，并在加入法尼醇24 h 后，進行菌株增殖情況的比較，顯示耐藥菌的增殖被顯著抑制，表明法尼醇對氟康唑耐藥白念珠菌的增殖具有抑制作用。

胱天蛋白酶家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起非常重要的作用，其中胱天蛋白酶3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子。激活后的胱天蛋白酶3 通過裂解切割多種胞漿、胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14]。 本研究選擇測定2 組菌株胞內(nèi)的胱天蛋白酶3 活性水平來觀察細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加入法尼醇后，氟康唑耐藥組的胱天蛋白酶3 活性水平為對照組的（1.84±0.70）倍，提示法尼醇能夠促進耐藥白念珠菌細(xì)胞凋亡。

根據(jù)之前文獻推測法尼醇誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)的作用機制很可能是：法尼醇和還原型谷胱甘肽形成結(jié)合物后，由耐藥真菌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的Pgp 將該復(fù)合物排出， 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽濃度降低，ROS 活性增強，過高的ROS 水平會使得耐藥真菌通過細(xì)胞凋亡途徑死亡[15]。 本研究發(fā)現(xiàn)耐藥組中的還原型谷胱甘肽含量下降，ROS 活性水平上升。上述結(jié)果提示法尼醇可使耐藥真菌體內(nèi)谷胱甘肽減少，導(dǎo)致其體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，抗氧化能力下降，耐藥真菌細(xì)胞內(nèi)ROS 增高，之后通過激活胱天蛋白酶族，促進白念珠菌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致耐藥白念珠菌增殖顯著受抑。

本研究初步發(fā)現(xiàn)法尼醇對于氟康唑耐藥的白念珠菌有促進細(xì)胞凋亡、抑制耐藥真菌增殖的作用，其可能的機制為法尼醇導(dǎo)致耐藥白念珠菌細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量下降，ROS 水平上升， 胱天蛋白酶3 酶活性增加，最終導(dǎo)致耐藥白念珠菌細(xì)胞凋亡。 鑒于白念珠菌耐藥的復(fù)雜性，本研究結(jié)果或?qū)槟退幇啄钪榫难芯糠较蛱峁┬碌倪x擇。