哈福雙， 韓 濤， 唐 飛， 閆俊卿， 王浩宇

天津市第三中心醫(yī)院，天津市重癥疾病體外生命支持重點實驗室， 天津市人工細胞工程技術研究中心，天津市肝膽研究所， 天津 300170

肝細胞癌(HCC)是世界范圍內最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，在過去幾十年成為癌癥相關最主要的死亡原因之一[1]。由于患者不適癥狀出現(xiàn)較晚，難以早期發(fā)現(xiàn)，只有不到20%的HCC患者能夠接受根治性手術切除、消融或原位肝移植，而大多數進展期HCC患者只能接受姑息性治療[2]。自2007年引入分子靶向藥物索拉非尼以來，HCC的系統(tǒng)性治療已經發(fā)生了巨大變化，特別是2017年9月、2018年11月美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)先后批準程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein-1, PD-1)抑制劑納武利尤單抗、帕博利珠單抗用于治療進展期HCC以來，HCC的治療進入了免疫治療時代。然而數據表明只有少數HCC患者受益于這種治療方案。目前，大量研究旨在找到免疫治療的優(yōu)化人群，從而提高抗腫瘤療效。

1 HCC患者肝臟的免疫特點

肝臟有肝動脈和門靜脈雙重血供系統(tǒng)，肝血竇中充滿免疫細胞，肝細胞同時暴露在大量腸道病原體及無害抗原如營養(yǎng)抗原中[3]。肝臟為適應這種獨特的抗原暴露環(huán)境而呈現(xiàn)一種固有的免疫耐受狀態(tài)[4]。HBV、HCV、酒精等均可導致肝臟的慢性炎癥反應，故HCC是在肝臟慢性炎癥狀態(tài)下發(fā)生的惡性腫瘤。這種慢性炎癥基礎促進了抑制性免疫細胞因子進一步抑制免疫反應并有利于腫瘤細胞生長[5]。在HCC進展過程中，由于這些細胞因子的分泌，調節(jié)性T淋巴細胞和骨髓來源的免疫抑制細胞也被募集到腫瘤部位，進一步強化了已經存在的免疫抑制狀態(tài)[5-6]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)在HCC病灶中常見的幾種免疫檢查點信號通路受體會上調，使得免疫細胞無法激活并攻擊腫瘤細胞[7]。

2 抑制PD-1及其配體(PD-L1)信號通路治療HCC的療效

PD-1是一種廣泛表達于多種免疫細胞類型的細胞表面蛋白，如CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等[8]。PD-L1與PD-1連接后，可直接抑制T淋巴細胞的增殖和其效應功能[9]。生理條件下，此信號通路用以維持炎癥穩(wěn)態(tài)、保護組織完整性并防止不必要的自身免疫反應[10]。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，PD-1/PD-L1信號通路上調，使得肝臟微環(huán)境中有效的抗腫瘤免疫監(jiān)測功能受損[11]。基于CheckMate 040及KEYNOTE 224的研究結果，F(xiàn)DA于2017年9月、2018年11月分別批準PD-1抑制劑納武利尤單抗、帕博利珠單抗作為進展期HCC的二線治療用藥。盡管新的治療方案給HCC患者帶來了更多的希望，但PD-1/PD-L1受體抑制劑大約在80%的HCC患者中效果欠佳。此外，其治療費用高昂，藥物相關不良反應發(fā)生率較高[12]，迫切需要找到治療效果預測因素，使患者得到更多臨床獲益。

3 應用PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的可能預測因素

HCC患者應用PD-1/PD-L1抑制劑治療效果不佳的原因復雜，包括免疫原性的突變、細胞因子信號缺陷和腫瘤細胞上調免疫檢查點途徑相關信號因子等。迄今為止，關于HCC應用PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的預測生物標志物的報道甚少。本文將回顧在HCC及其他腫瘤類型中進行研究的生物標志物，這些標志物均可能與PD-1/PD-L1抑制劑治療HCC效果預測相關。

3.1 PD-L1的表達 有研究[13]表明，非小細胞肺癌患者中，高表達的PD-L1水平與較高的客觀緩解率和生存率有關，然而，CheckMate-040研究[14]結果卻顯示，HCC患者基線腫瘤細胞PD-L1水平對客觀緩解率沒有明顯的影響。在某些腫瘤類型中，腫瘤組織浸潤免疫細胞上的PD-L1表達水平可能比腫瘤細胞上的PD-L1表達水平更能預測PD-1/PD-L1抑制劑的治療效果[15]。因此，HCC浸潤免疫細胞上的PD-L1表達水平可能是對PD-1/PD-L1抑制劑反應的潛在標志物。為明確此種假設，需進一步解決以下問題：如何定義PD-L1高表達的界限值[16]；統(tǒng)一用于檢測PD-L1水平的抗PD-L1 抗體，提高實驗結果的可靠性和重復性[17]。

3.2 腫瘤突變負荷和微衛(wèi)星不穩(wěn)定 腫瘤在轉化和發(fā)展過程中獲得了不同的體細胞突變，腫瘤細胞的遺傳異質性是惡性腫瘤的基本特性[18]。腫瘤突變負荷(tumor mutation burden, TMB)被定義為腫瘤基因組中每個編碼區(qū)域的突變總數，其范圍從數個到數千個不等[19]。體細胞突變如點突變、框移突變或插入、刪除突變，產生新的蛋白質或肽序列被稱為新抗原。TMB水平較高的腫瘤一般表達了更多的新抗原，這些新抗原可能使免疫系統(tǒng)產生更強的抗腫瘤反應，因此可能對免疫治療產生更好的效果。高水平TMB已被證實為多種惡性腫瘤應用PD-1/PD-L1抑制劑更佳療效的獨立預測因素[20]。但是，如果TMB未能表達高質量的新抗原則可能導致T淋巴細胞并不攻擊腫瘤細胞。例如參與MAP激酶通路活化的KRAS和BRAF基因突變或其他突變，可減少Ⅰ類MHC分子的表達或影響肽合成過程中的重要分子，導致即使在高TMB患者中，抗腫瘤免疫能力依舊不足[21-22]。目前，測定TMB需要進行全外顯子測序，費用昂貴且耗時較長[23]。因此，應用TMB預測HCC患者應用PD-1/PD-L1抑制劑治療的效果，仍需進一步探討。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite stability, MSI)是由錯配修復缺陷引起的超突變表型，是FDA批準的首個PD-1抑制劑治療的預測生物標志物[24]。然而目前數據表明，在HCC患者中,很少能觀察到MSI[25]。

3.3 腫瘤微環(huán)境 目前，普遍認為腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)的異質性可能是導致腫瘤特異性T淋巴細胞活化、克隆增殖以及腫瘤免疫治療效果差異的部分原因[26]。腫瘤微環(huán)境大體分為兩個類型:其一，“熱”免疫炎癥型TME：表現(xiàn)為更高密度的CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞；更高水平的干擾素和干擾素刺激趨化因子,如CXCL9、CXCL11等[27]。一項薈萃分析[28]表明，CD8+T淋巴細胞的浸潤與多種實體腫瘤類型的化療和免疫治療反應的改善有關。有研究[29]顯示，腫瘤細胞對PD-1抑制劑的應答需要預先存在CD8+T淋巴細胞，這些細胞受PD-1/PD-L1介導的適應性免疫耐受負調控。故“熱”免疫炎癥型TME可能預示PD-1/PD-L1抑制劑的治療獲益。其二，“冷”免疫炎癥型TME，通常表達與免疫抑制或耐受相關的細胞因子，如IL-10、IL-35、IL-4、TGFβ等，這類腫瘤通常對PD-1/PD-L1抑制劑治療反應較差[30-31]。但在HCC患者中，對腫瘤微環(huán)境的評估仍存在不可忽視的問題。首先，此類檢查需要肝組織活檢，并需要幾種抗體的組合、應用免疫組織化學方法來驗證，實驗過程復雜；其次，HCC患者尤其是多灶性HCC患者存在腫瘤異質性，活檢樣本難以反應腫瘤病灶全貌。因此，現(xiàn)階段應用TME預測HCC患者對PD-1/PD-L1抑制劑的治療反應仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。

3.4 液體活檢 “液體活檢”是指對血液或其他體液進行低侵入性或非侵入性檢測以提供患者腫瘤遺傳信息的一種檢查方法，避免了有創(chuàng)肝組織活檢中腫瘤異質性及取樣變異性的弊端[32-33]?！耙后w活檢”的腫瘤信息來源包括循環(huán)腫瘤游離DNA、循環(huán)腫瘤細胞、從體液中(如血清、血漿、尿液、唾液)循環(huán)的外泌體等。雖然“液體活檢”已經在結直腸癌、乳腺癌和肺癌中用以預測治療反應和監(jiān)測復發(fā)[33]，但在HCC臨床應用的數據仍舊有限。下面列舉相對有前景的“液體活檢”檢測項目及目前研究結果：(1)中性粒細胞與淋巴細胞比率是非小細胞肺癌對納武利尤單抗治療效果的預測因素之一[34]。(2)在HCC中，PD-1等免疫檢查點分子在腫瘤組織中的表達水平，可部分由檢測血液循環(huán)中免疫細胞的檢查點分子的表達間接反應[35]。(3)基線高水平抗炎癥細胞因子TGFβ可能與進展期HCC患者PD-1抑制劑治療后預后差相關[36]。(4)基線高水平可溶性PD-L1水平與HCC患者較差預后相關[37]。(5) 細胞外囊泡如外泌體和微囊泡從包括腫瘤細胞在內的各種細胞釋放，并攜帶影響免疫系統(tǒng)的生物活性分子。有研究[38]表明，對PD-1抑制劑有治療應答的黑色素瘤患者，在治療早期循環(huán)外分泌體中PD-L1水平增加。(6)有證據表明，評估循環(huán)腫瘤游離DNA中的TMB可能是可行的，它避免了肝活檢中同一患者不同病灶的腫瘤的異質性和取樣的變異性[39]。綜上，“液體活檢”有可能成為預測HCC患者對PD-1/PD-L1抑制劑治療反應的重要工具。

3.5 腸道菌群 越來越多的證據表明，腸道菌群在肝臟炎癥和HCC發(fā)生的過程中起到關鍵作用[40]。對免疫檢查點抑制劑的原發(fā)耐藥可能是由患者的腸道微生物成分異常導致的(如抗生素相關的腸道菌群失調)[41]。而且，腸道微生物菌落特性還可能與免疫相關的藥物不良事件的發(fā)生有關，如治療導致的免疫相關性小腸結腸炎[42]。目前，腸道菌群對免疫檢查點抑制劑應答的影響尚未在HCC中得到明確驗證，仍需進一步研究。

3.6 性別及年齡 一項對免疫檢查點抑制劑的隨機對照試驗進行的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，男性的總體生存獲益明顯高于女性[43]。一項回顧性研究[44]指出，與男性相比，年齡<65歲的女性患者對PD-1抑制劑治療的客觀反應率較低。另有研究[45]表明，年齡在60歲以上的患者對PD-1抑制劑治療有更好的反應。無論男性還是女性，衰老都與性激素的喪失有關，因此，性別相關的差異可能會隨著年齡的增長而部分消失。目前，關于性別和年齡對療效的影響還需要進一步研究。

4 未來展望

目前，HCC已跨入免疫治療的新時代，PD-1/PD-L1抑制劑給HCC患者帶來了新的希望，但目前絕大部分患者療效欠佳。尋找高敏感性、高特異性預測治療效果的生物標志物，對于優(yōu)化治療方案是必要的。盡管目前在其他腫瘤的治療中已有一些有希望的預測因素進入了研究者的視野，但關于預測HCC患者治療效果的生物標志物的報道甚少，仍需要大量的研究予以探索。