王 程，鄭慧琳，常雨薇，柴科杰，章鵬飛，徐偉明

(杭州師范大學材料與化學化工學院，浙江 杭州 311121)

自從人類第一次用氣相沉積法制成了電致發(fā)光(EL)裝置后，有機發(fā)光二極管(OLED)的研究越來越引起大家的興趣[1-4].它的各種光學和電子特性穩(wěn)定，這正好契合了高效有機材料以及制造技術的需要.在傳統(tǒng)的發(fā)光材料中，發(fā)光物質(zhì)在溶液中能發(fā)出很強的熒光，但在聚集態(tài)或固態(tài)卻沒有熒光發(fā)出.最近，具有聚集誘導發(fā)光(AIE)的分子引起了人們的熱捧.在這其中，四苯基乙烯(TPE)(圖1)是一種結(jié)構簡單且具有明顯的聚集誘導發(fā)光的分子[5-8].科學家們利用TPE分子去構建不同的固態(tài)發(fā)光物質(zhì)和其他功能性材料，尤其在有機發(fā)光二極管和生物檢測等方面[9-10].傳統(tǒng)的發(fā)光物質(zhì)在聚集狀態(tài)的熒光往往是猝滅的，這就是聚集導致的熒光猝滅現(xiàn)象(ACQ).這種熒光猝滅現(xiàn)象很大程度上限制了生物樣品的標記濃度，讓研究者不得不采用稀溶液來做生物檢測，從而降低了檢測的靈敏度.而利用四苯基乙烯具有的聚集誘導發(fā)光特性，可以使高濃度的分子在聚集狀態(tài)也發(fā)出很強的熒光，并用于生物檢測.

圖1 TPE結(jié)構圖Fig.1 The structure of TPE

本研究將TPE分子連接到紫檀芪和疊氮取代的三嗪分子上，得到了一種含有四苯基乙烯結(jié)構的聚集誘導發(fā)光紫檀芪衍生物分子，進一步研究了分子的毒性及細胞攝取等相關生物活性和藥理學性質(zhì).這種優(yōu)質(zhì)低毒的熒光探針物質(zhì)的引入，使之在作為藥物載體的同時，可以更直觀地觀察到藥物在體內(nèi)的移動和釋放.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵、2XZ-2型旋片真空油泵、R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、ZF-1型紫外分析儀、XS204電子天平、HZ-9310K型恒溫振蕩培養(yǎng)箱、酶標儀(BIO-RAD680，配570 nm濾光片)、倒置熒光顯微鏡、磁力攪拌器、離心機、烘箱及其他有機合成玻璃儀器.

1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯基乙烯、四三苯基膦鈀、碘化亞銅、2-甲基-3-丁炔-2-醇、三乙胺、石油醚、乙酸乙酯、甲苯、氫氧化鉀、2-疊氮-4-氯-6-[4-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯氧基]三嗪、介孔銅氧化物、叔丁醇、水、鹽酸、無水硫酸鎂、四氫呋喃、HELA細胞、COS-7細胞、CHL細胞、GSE細胞、乙醇、二甲基亞砜等.

試劑均系市售商品或工業(yè)品，用前未經(jīng)處理.

1.2 四苯乙烯基乙炔的制備(圖2)

稱取0.822 g 1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯基乙烯、0.15 g Pd(Ph3P)4、0.025 g CuI、0.242 mL 2-甲基-3-丁炔-2-醇，NEt3作為溶劑，劇烈加熱回流4 h后，冷卻至室溫，過濾，將濾液轉(zhuǎn)干，以石油醚和乙酸乙酯(體積比為3∶1)作為洗脫劑柱層析分離得0.692 g黃色油狀物1，產(chǎn)率為83.5%.

稱取0.828 g(2 mmol)產(chǎn)物1、0.112 g(2 mmol)KOH，甲苯作為溶劑，加熱回流3 h后，冷卻至室溫，用10 mL質(zhì)量分數(shù)為10%的鹽酸洗滌1次，再用100 mL水洗滌2次，干燥過濾，旋干，以石油醚作為洗脫劑柱層析分離得到0.400 g白色固體2，產(chǎn)率為56.1%.

圖2 合成路線1Fig.2 Synthesis route 1

1.3 2-氯-4-[4-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯氧基]-6-{4-[4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基]-1H-1,2,3-三唑-1-基}三嗪的制備(圖3)

將0.493 g(1.2 mmol)2-疊氮-4-氯-6-[4-(3,5-二甲氧基苯乙烯基)苯氧基]三嗪(化合物3)、0.356 g(1 mmol)產(chǎn)物2、0.008 g(0.1 mmol)介孔銅氧化物、20 mL叔丁醇、2 mL水，攪拌溶解加熱至90 ℃，反應10 h.過濾，把叔丁醇旋干，用10 mL乙酸乙酯萃取洗滌，無水硫酸鎂干燥，用石油醚和乙酸乙酯(體積比為15∶1)作為洗脫劑柱層析的方法分離，得到0.430 g產(chǎn)物4，產(chǎn)率為56%.

圖3 合成路線2Fig.3 Synthesis route 2

1.4 產(chǎn)物的表征

[2-(4-Ethynylphenyl)ethene-1,1,2-triyl]tribenzene (產(chǎn)物2)[11]

Mp: 152～153 ℃.

MS (ESI):m/z(%) 357.164 0 [M+H]+.

IRvmax/cm-1: 3 440, 3 276, 3 072, 3 020, 1 519, 1 442, 1 262, 1 071, 1 028.

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.28～6.96 (m, 19H), 3.05 (s, 1H).

2-Chloro-4-[4-(3,5-dimethoxystyryl)phenoxy]-6-{4-[4-(1,2,2-triphenylvinyl)phenyl]-1H-1,2,3-triazol-1-yl}-1,3,5-triazine (產(chǎn)物4)[12]

Mp: 165～166 ℃.

MS (ESI):m/z(%) 767.253 8 [M+H]+.

IRvmax/cm-1: 3 445, 3 072, 3 020, 2 961, 2 916, 2 849, 2 190, 1 752, 1 623, 1 588, 1 532, 1 465, 1 420, 1 365, 1 295, 1 120, 1 051, 1 023.

1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1H), 7.68 (d,J=8.3 Hz, 2H), 7.62 (d,J=8.6 Hz, 2H), 7.26 (d,J=8.6 Hz, 2H), 7.11 (dddd,J=14.1, 10.0, 8.7, 6.6 Hz, 19H), 6.71 (d,J=2.1 Hz, 2H), 6.45 (s, 1H), 3.87 (s, 6H).

1.5 化合物的紫外及熒光檢測

圖4(a)為產(chǎn)物2和化合物3在99%的水和100%的四氫呋喃(THF)中的熒光圖譜，圖4(b)為產(chǎn)物4在99%的水和100%的THF中的熒光圖譜.如圖4(a)所示，在350 nm波長的激發(fā)下，產(chǎn)物2在THF中幾乎沒有熒光，而在含99%水的溶液中，具有很強的熒光，且發(fā)射波長為494 nm，說明產(chǎn)物2具有明顯的AIE現(xiàn)象，即聚集誘導發(fā)光效應.而在相同條件下，化合物3在THF和含99%水的溶液中都無明顯的熒光現(xiàn)象.圖4(b)中350 nm波長的激發(fā)下，產(chǎn)物4在THF中也幾乎沒有熒光，而在99%水的溶液中，具有很強的熒光，其發(fā)射波長為496 nm.與產(chǎn)物2相比，略有紅移，但不是很明顯.圖4(c)紫外吸收光譜顯示，化合物3在310 nm處有吸收，產(chǎn)物2在321 nm處有吸收，產(chǎn)物4在333 nm處有吸收.

(a)化合物3、產(chǎn)物2的熒光紫外譜圖;(b)產(chǎn)物4的熒光紫外譜圖;(c)化合物3、產(chǎn)物2、產(chǎn)物4的紫外吸收光譜圖.

1.6 MTT法測定產(chǎn)物2和產(chǎn)物4的細胞毒性

1)細胞接種： ①HELA細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液； ②用0.25%胰蛋白酶消化單層COS-7細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液； ③CHL細胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細胞懸液； ④GSE細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，將細胞接種到96孔板上，每孔8 000個細胞，每孔體積200 μL.

2)細胞培養(yǎng)：將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)16～18 h.

3)吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞，加入無血清培養(yǎng)液，在細胞板孔中分別加入產(chǎn)物2和產(chǎn)物4的DMSO溶液，使每孔中產(chǎn)物2和產(chǎn)物4的質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、120、160、200、240 μg/mL，每孔液體的總體積為200 μL(每個樣品每種濃度均為三復孔).

4)產(chǎn)物2和產(chǎn)物4與細胞共孵育24 h.

5)吸去培養(yǎng)基，每孔加入90 μL無血清培養(yǎng)液和10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育3 h.

6)翻板法棄去液體，每孔加入100 μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩10 min.

7)在酶標儀上測570 nm波長處OD值.

8)統(tǒng)計細胞活力.

由圖5可見，產(chǎn)物2對4種細胞的活性影響不大，屬于低毒范圍.產(chǎn)物4則毒性較大，在GSE和HELA細胞中當其質(zhì)量濃度達到80 μg/mL時，細胞毒性低于50%，而在CHL和COS-7細胞上其質(zhì)量濃度達到40 μg/mL時，細胞已經(jīng)全部失活.分析研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物4對上皮組織細胞的毒性較大，而紫檀芪屬于抗氧化的抗癌輔助天然化合物，理論上屬于低毒化合物，所以可能是由于該化合物中含有活潑的氯原子，對上皮組織中的某種酶有影響，故毒性較大.

圖5 產(chǎn)物2和產(chǎn)物4對4種不同細胞在不同濃度下的細胞毒性

1.7 產(chǎn)物2和產(chǎn)物4的細胞攝取實驗

1)細胞接種.

將普通潔凈蓋玻片放入70%乙醇中浸泡5 min，于超凈臺內(nèi)吹干.將蓋玻片置于24孔板內(nèi)，種入細胞培養(yǎng)過夜，使細胞密度為70%～80%.將圓形載玻片放入24孔板的每個孔中.

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細胞懸液，將細胞接種到24孔板上，每孔2×104個細胞，每孔體積500 μL.于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細胞密度為70%～80%時進行攝取實驗.

2)產(chǎn)物2和產(chǎn)物4的溶液分別用DMSO配制成20 μg/mL的溶液.

3)細胞攝取實驗.

孵育24 h后，將24孔板中的培養(yǎng)液吸去，加入400 μL無血清的DMEM培養(yǎng)液，將配好的兩種溶液分別加入24孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h后取出，重復前一步驟，再吸去兩個孔板中的培養(yǎng)液，加入400 μL無血清的DMEM培養(yǎng)液，將配好的兩種溶液分別加入24孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h.

吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，每次200 μL，吸去PBS，每孔加入200 μL 0.5 μg/mL的Hoechst溶液，孵育6 min后，吸去Hoechst溶液，用PBS洗滌3次.

4)倒置熒光顯微鏡觀察.

由圖6可發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物4在細胞吞噬3 h后熒光負載的藥物比0.5 h的要多，且與產(chǎn)物2比較發(fā)現(xiàn)，無論是3 h還是0.5 h，產(chǎn)物4的細胞吞噬效果都要比產(chǎn)物2好.分析其原因，可能是由于分子量的增大使得細胞更易吞噬且不易流出，所以分子量大的產(chǎn)物4更易被細胞吞噬.這一結(jié)果使筆者將熒光與藥物相結(jié)合的設想成為可能，可以更直觀地看出藥物被細胞吞噬的形態(tài)、數(shù)量及分布狀況[13].

(a)0.5 h產(chǎn)物2；(b)0.5 h產(chǎn)物4；(c)3 h產(chǎn)物2;(d)3 h產(chǎn)物4.

2 結(jié)果與討論

本研究把具有AIE聚集誘導發(fā)光效應的四苯乙烯基引入到三氯三嗪分子中，同時連載上具有抗氧化性的輔助抗腫瘤分子紫檀芪，通過熒光測定，確定分子在水中仍具有聚集誘導發(fā)光的特性.MTT檢測發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物2在不同細胞中毒性較小，但隨著濃度的增加毒性有所加強，在相同條件下，產(chǎn)物4由于分子中有氯元素的存在，毒性更大.細胞攝取實驗發(fā)現(xiàn)在一定時間內(nèi)，吞噬時間越長，細胞攝取效果越好，產(chǎn)物4因含有抗氧化性的紫檀芪且分子量較大，所以細胞攝取情況優(yōu)于產(chǎn)物2.

這一系列的檢測說明，我們可以利用產(chǎn)物4熒光顯色的特性，研究其被細胞吞噬后藥物的分布、數(shù)量及形態(tài)等，使得對三嗪化合物產(chǎn)物4的研究不再停留在最基礎的化學合成階段，對它的藥理性能也有了更多的認識，為下一步靶向藥物分子設計奠定了良好基礎.