張松濤 孫賓娟 馬潔

【摘要】 目的 研究超高效液相色譜（UPLC）法在測定黃芪降壓方提取液中黃芪甲苷、柚皮苷兩種活性成分的含量。方法 利用UPLC對黃芪降壓方的提取藥液進(jìn)行分析，流動相用乙腈-去離子水測定，色譜柱運用Agilent SB C18柱來測定，ESI離子源的檢測離子對分別是829/783及579/271，以此實施UPLC測定，分析UPLC的應(yīng)用價值。結(jié)果 黃芪甲苷、柚皮苷線性關(guān)系較好（r>0.999）;黃芪甲苷平均回收率為100.34%，RSD值為1.89%;柚皮苷平均回收率為101.02%，RSD值為1.74%;連續(xù)6次測定，黃芪甲苷RSD值為1.36%，柚皮苷為1.43%;不同人員進(jìn)行檢測，黃芪甲苷RSD值為1.80%，柚皮苷為2.27%，不同時間測定，黃芪甲苷RSD值為2.55%，柚皮苷為1.91%;24 h內(nèi)黃芪甲苷的RSD值為1.85%，柚皮苷的為2.97%。結(jié)論 UPLC對于黃芪降壓方中黃芪甲苷、柚皮苷檢測具有較高準(zhǔn)確性和精密度，可為臨床評價治療效果質(zhì)量提供參考數(shù)據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 超高效液相色譜法;黃芪降壓方;柚皮苷;黃芪甲苷

中圖分類號：R927.2 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.10.011

【Abstract】 Objective To study the content of astragaloside IV and naringin in the extract of Astragalus hypotension prescription tested by ultra high performance liquid chromatography （UPLC）. Methods The extracted liquid of Astragalus hypotensive prescription was analyzed by UPLC， the mobile phase was tested by acetonitrile-deionized water， the chromatographic column was tested by Agilent SB C18. The detection ion pair of ESI ion source was 829/783 and 579/271， respectively， they were tested by UPLC to analyze the application value of UPLC. Results The linear relationship between astragaloside IV and naringin was good （r > 0.999）. The average recovery rate of astragaloside IV was 100.34% and RSD value was 1.89%. The average recovery rate of naringin was 101.02% and RSD value was 1.74%. 6 consecutive tests showed that the RSD value of astragaloside IV and naringin were 1.36% and 1.43%， respectively. Tests by different persons showed that the RSD value of astragaloside IV and naringin were 1.80% and 2.27%， respectively. Tests in different times point showed that the RSD value of astragaloside IV and naringin were 2.55% and 1.91%， respectively. Within 24 h， the RSD value of astragaloside IV and naringin were 1.85% and 2.97%， respectively. Conclusion UPLC has high accuracy and precision in detecting astragaloside IV and naringin in Astragalus hypotensive prescription， which can provide reference data for clinical evaluation of therapeutic effect quality.

【Key words】 UPLC;Astragalus hypotensive prescription;naringin;astragaloside IV

黃芪降壓方組方成分為茯苓、化橘紅、黃芪等多種藥材，具有祛濕逐瘀、通絡(luò)活血以及降壓降脂效果，而化橘紅和黃芪屬于君藥，其中黃芪性味溫甘，可利水消腫、益氣固表，現(xiàn)代藥理研究證實其具有降血壓以及提高免疫力的效果;化橘紅性溫味辛、苦，可化痰止咳，現(xiàn)代藥理研究證實其具有降血脂效果。兩者聯(lián)合應(yīng)用具有較高的軟化血管以及降血壓的作用[1～3]。截止到目前，有關(guān)黃芪降壓方中的黃芪、化橘紅化學(xué)成分和質(zhì)量控制的研究主要采用指紋圖譜法，無法實現(xiàn)對全方中的主要活性成分進(jìn)行同時檢測[4～5]。本研究采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法對黃芪降壓方提取液中柚皮苷、黃芪甲苷成分含量進(jìn)行測定，報告如下。

1 材料與方法1.1 儀器材料 高效液相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Accela型號自動進(jìn)樣器和高壓泵、ESI離子源、三重四級桿）;美國Agilent公司的Agilent SB C18柱（2.7 μm，2.1×100 mm）;XS205DU型號的電子分析天平;低溫高速的離心機;恒溫數(shù)控的超聲波清洗器;渦旋混合儀;氮氣干燥劑;批號為110844-201109、純度為98%的柚皮苷、黃芪甲苷的對照品;UPLC法所用的分析試劑均屬于色譜純;藥材提取的所用試劑均屬于分析純。

1.2 方法

1.2.1 制備對照品溶劑 取適量柚皮苷、黃芪甲苷的對照品于10 mL的量瓶內(nèi)，利用甲醇予以溶解、稀釋到刻度，獲取各化學(xué)物的含量為10 μg·mL-1對照品混合劑。

1.2.2 制備供試品溶劑 取黃芪降壓方藥材，加500 mL水煎煮2次，每次1 h，合并水煎液，再次加熱使其濃縮到100 mL，過濾;取1 mL濾液，添加甲醇予以逐級稀釋到原濃度1000倍得供試品溶劑。

1.3 UPLC法條件 通過ESI離子源進(jìn)行質(zhì)譜分析，于正負(fù)離子模式下予以同時掃描，負(fù)離子噴霧電壓3000 V，離子傳輸管的溫度300℃，汽化室溫度350℃，管徑補償電壓為100 V，輔氣壓力為10 psi，鞘氣壓力為30 psi，通過選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（select reaction monitoring，SRM）進(jìn)行掃描，黃芪甲苷的檢測離子對是829/783，其碰撞電壓是20 V;柚皮苷的檢測離子對是579/271，其碰撞電壓是29 V。通過等度洗脫方式進(jìn)行UPLC分離，流動相利用60∶40、v/v的乙腈-去離子水溶液，洗脫時間是4 min，柱溫為25℃，流速為300 μL·min-1，進(jìn)樣量是10 μL。

1.4 方法學(xué)

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線以及線性 取適量對照品混合劑于10 mL量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋達(dá)刻度，可獲得20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1、1000 ng·mL-1的不同濃度溶劑，取上述溶劑依據(jù)“1.3”中方法實施UPLC分析，后記錄總離子流圖，其中橫坐標(biāo)X為各個分子離子峰的峰面積，縱坐標(biāo)為濃度，實施線性回歸。結(jié)果顯示方法線性良好（r黃=0.9991，r柚=0.9995）可于20～1000 ng·mL-1范圍內(nèi)對于相關(guān)的化合物予以準(zhǔn)確定量。

1.4.2 測試圖譜 于室溫下，對黃芪甲苷、黃芪甲苷對照品、柚皮苷以及柚皮苷對照品進(jìn)樣后予以17 min色譜圖，分別為圖1、圖2。

1.4.3 準(zhǔn)確度、精密度 通過提取回收率方式對準(zhǔn)確度予以測定，其步驟為：取5 mL供試品溶劑于10 mL量瓶內(nèi)，加適量柚皮苷、黃芪甲苷的對照品，加甲醇定容到刻度獲取標(biāo)準(zhǔn)添加劑;取標(biāo)準(zhǔn)添加劑依據(jù)“1.3”步驟予以連續(xù)UPLC分析，對每份樣品進(jìn)行2次測定，記錄峰面積，對回收率以及RSD值進(jìn)行計算。

1.4.4 中間精密度 取同一份供試品溶劑，由3名不同的人員，于1 d內(nèi)依據(jù)“1.3”的方式進(jìn)行UPLC分析3次，另由同一名實驗人員連續(xù)3 d依據(jù)“1.3”方式測定，每天3次，對峰面積進(jìn)行記錄，并計算RSD值。

1.4.5 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶劑于自動進(jìn)樣器內(nèi)，分別在2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h依據(jù)“1.3”中方式連續(xù)實施UPLC分析，并記錄峰面積，進(jìn)行RSD值計算。

1.5 測定黃芪降壓方不同批次的藥材活性 取黃芪降壓方藥材10份，依據(jù)“1.2”中方法制作供試品溶劑，依據(jù)“1.3”中方法對含量進(jìn)行測定，經(jīng)峰面積進(jìn)行記錄，并對各組含量進(jìn)行測定。

2 結(jié) ?果2.1 準(zhǔn)確度、精密度 黃芪甲苷平均回收率為100.34%，RSD值為1.89%，柚皮苷平均回收率為101.02%，RSD值為1.74%。見表1、表2。連續(xù)測定6次，黃芪甲苷RSD值為1.36%，柚皮苷為1.43%。

2.2 中間精密度 不同人員進(jìn)行檢測，黃芪甲苷RSD值為1.80%，柚皮苷為2.27%;不同時間測定，黃芪甲苷RSD值為2.55%，柚皮苷為1.91%。

2.3 穩(wěn)定性考察 24 h內(nèi)的黃芪甲苷的RSD值為1.85%，柚皮苷為2.97%。

2.4 黃芪降壓方不同批次的藥材活性 黃芪甲苷的含量平均為0.1383 mg·mL-1，RSD值為9.82%，而柚皮苷的平均含量是0.3391 mg·mL-1，RSD值是4.16%。見表3。

3 討 ?論 ?黃芪甲苷的含量檢測屬于黃芪制劑主要質(zhì)量檢測指標(biāo)，早期以薄層掃描的檢測方式為主，其操作繁瑣，且重現(xiàn)性較差，加上黃芪甲苷對于紫外末端具有吸收效果，致使紫外檢測法的靈敏度較低，且雜質(zhì)干擾效果明顯，進(jìn)一步降低敏感性[6]。故需尋找更為適合的檢測方式。在黃芪降壓方中主要成分為黃芪及化橘紅，而臨床常用蒸發(fā)光散射計測器測定對于黃芪甲苷較為敏感，但對于化橘紅的主要活性物質(zhì)敏感性較差，無法準(zhǔn)確測量其含量。因此仍需尋找更為有效測定方式，可對多個主要活性成分的含量進(jìn)行同時測定。

UPLC屬于分離科學(xué)中全新類別，其基于高效液相色譜原理以及理論，并包括極低系統(tǒng)體積、小顆粒填料和快速檢測手段等一種全新技術(shù)，可提高分析靈敏度、色譜峰的容量以及通量[7]。UPLC的Agilent SB C18柱的粒徑為2.7 μm，有助于分離物質(zhì)，進(jìn)而提高準(zhǔn)確性、精密度，利用自動進(jìn)樣器可有效降低交叉污染發(fā)生率、擴(kuò)散率，進(jìn)一步確保測定含量的準(zhǔn)確性，加之其準(zhǔn)確度上升，縮短分析時間，減少檢測溶劑量，降低測定成本[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷、柚皮苷的線性關(guān)系比較好（r>0.999），說明線性范圍較寬;而黃芪甲苷平均回收率為100.34%，RSD值為1.89%，柚皮苷平均回收率為101.02%，RSD值為1.74%，說明UPLC的準(zhǔn)確度較高，并經(jīng)連續(xù)測定6次顯示，黃芪甲苷RSD值為1.36%，柚皮苷為1.43%，代表UPLC的精密度較高，且不同人員檢測結(jié)果顯示為黃芪甲苷RSD值為1.80%，柚皮苷為2.27%，不同時間測定結(jié)果顯示為黃芪甲苷RSD值為2.55%，說明方法的中間精密度較高。此外，24 h內(nèi)黃芪甲苷的RSD值為1.85%，柚皮苷的為2.97%，說明黃芪降壓方的活性物質(zhì)在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性較高，另外本研究10份樣品中，黃芪甲苷的含量平均為0.1383 mg·mL-1，RSD值為9.82%，而柚皮苷的平均含量是0.3391 mg·mL-1，RSD值是4.16%，可知UPLC法具有簡便快捷，準(zhǔn)確性、精密度、穩(wěn)定性均較高的特點。

綜上所述，利用UPLC法測定黃芪降壓方提取液中黃芪甲苷、柚皮苷兩種活性成分含量，具有快捷簡便以及準(zhǔn)確性、精密度、穩(wěn)定性高特點，且可為臨床提高治療效果質(zhì)量提供可靠數(shù)據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-03-19 修回日期：2020-06-23）

（編輯：潘明志）