劉孝賀，孫麗娜，張懷江，仇貴生

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，遼寧興城 125100）

0 引言

隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，高毒高殘留的農(nóng)藥被限制使用，以及害蟲(chóng)的抗藥性逐漸增強(qiáng)，所以找到一種環(huán)保、高效、低成本的防治害蟲(chóng)的方法，對(duì)環(huán)境保護(hù)有著重要的意義[1]。因此，對(duì)害蟲(chóng)研究的熱點(diǎn)集中在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)蛋白OBPs 和CSPs，希望能夠利用性信息素干擾昆蟲(chóng)的交配，從而降低蟲(chóng)口密度，達(dá)到田間防治的效果。

昆蟲(chóng)對(duì)氣味分子的識(shí)別具有穩(wěn)定性、靈敏性和專(zhuān)一性的特點(diǎn)。該識(shí)別過(guò)程主要分為兩個(gè)階段：首先在外周神經(jīng)水平上，氣味分子通過(guò)昆蟲(chóng)感器上密布的極孔進(jìn)入到昆蟲(chóng)的淋巴液中。氣味分子一般是疏水性的小分子物質(zhì)，運(yùn)送到嗅覺(jué)神經(jīng)元(Olfactory Sensory Neurons,OSNs)激活信號(hào)受體，這時(shí)需要?dú)馕督Y(jié)合蛋白與氣味分子結(jié)合并將其運(yùn)送穿過(guò)親水性的淋巴液，氣味分子激活神經(jīng)元上的信號(hào)受體。此時(shí)，化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)沖動(dòng)在神經(jīng)元上進(jìn)行傳遞。其次信號(hào)傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行整合和加工指導(dǎo)昆蟲(chóng)的行為[2]。在這個(gè)過(guò)程中，需要多種蛋白的相互協(xié)作，如氣味結(jié)合蛋白(Odorant Binding Proteins,OBPs)與化學(xué)感受蛋白(Chemosensory Proteins,CSPs)用來(lái)篩選、結(jié)合、運(yùn)送氣味分子。氣味受體(Odorant Receptors,ORs)，離子型受體(Ionotropic Receptors,IRs)，感覺(jué)神經(jīng)膜蛋白(Sensory Neuron Membrane Proteins,SNMP)將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)沖動(dòng)。氣味降解酶(Odorant-Degrading Enzyme,ODE)將刺激受體后的氣味分子快速的降解，防止重復(fù)性的刺激[3]。ORs和IRs 具有識(shí)別與分辨不同氣味信號(hào)的功能。然而，疏水性的氣味分子穿過(guò)昆蟲(chóng)親水性的淋巴液需要兩種重要蛋白的結(jié)合和運(yùn)送，才能與受體結(jié)合。這2 種蛋白質(zhì)分別為OBPs和CSPs[4]。由于能夠在體外大量、穩(wěn)定的表達(dá)，OBPs 和CSPs 蛋白被廣泛研究。尤其是二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，獲得大量基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使得從分子層面對(duì)OBPs 和CSPs 的功能進(jìn)行闡釋。對(duì)于這兩類(lèi)蛋白的大多數(shù)研究都集中在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)系統(tǒng)，試圖揭示它們?cè)跈z測(cè)和識(shí)別外界環(huán)境刺激所發(fā)揮的功能。然而，越來(lái)越多的文章報(bào)道在昆蟲(chóng)的非嗅覺(jué)器官也發(fā)現(xiàn)了此類(lèi)蛋白，并且行使不同的功能。本研究對(duì)CSPs蛋白在昆蟲(chóng)體內(nèi)具有的不同功能進(jìn)行了綜述，以期為后來(lái)的研究者提供理論上的支持。

1 化學(xué)感受蛋白的結(jié)構(gòu)

CSPs是緊密的多肽，主要有α-螺旋結(jié)構(gòu)域形成的疏水性的結(jié)合口袋[5-6]，此結(jié)構(gòu)與昆蟲(chóng)OBPs 的結(jié)構(gòu)較為相似。1994 年，Mckenna 等在果蠅中首次發(fā)現(xiàn)編碼CSPs的基因，并被命名為OS-D，起初它們的功能并不被認(rèn)為與化學(xué)感受蛋白有關(guān)。直到后來(lái)Angeli等在沙漠蝗的觸角中發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)參與沙漠蝗化學(xué)信息素識(shí)別的蛋白質(zhì)，這也是“化學(xué)感受蛋白”名字的首次提出[7]。CSPs是一類(lèi)分子量相對(duì)較小的可溶性酸性蛋白質(zhì)，大小通常在13 ku 左右，由100～115 個(gè)氨基酸殘基組成[8]。它們?cè)谶M(jìn)化上高度保守，不同物種間相似性很高，并且存在明顯的高度保守結(jié)構(gòu)域。CSPs 會(huì)有4個(gè)保守的半胱氨酸保守位點(diǎn)，它們之間會(huì)兩兩配對(duì)形成2 個(gè)二硫鍵，以此維持穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。該類(lèi)蛋白不同物種間的種類(lèi)多樣性主要集中在C-端，有的物種會(huì)向外延伸，形成額外的結(jié)構(gòu)域；有的物種C-端會(huì)提前終止，序列長(zhǎng)度僅僅包含80～100 個(gè)氨基酸[2]。這類(lèi)蛋白已經(jīng)在松褐天牛(Monochamus alternatus)[9]、甜菜夜蛾(Sopdoptera exigua)[10]、小地老虎(Agrotis ypsilon)[11]、中華蜜蜂(Apis cerana)[12]、西花薊馬(Frankliniella occidentalis)[13]等昆蟲(chóng)中得到克隆。OBPs 基因在觸角等感受器官中富集，然而，研究發(fā)現(xiàn)CSPs 廣泛分布于各個(gè)組織，如在體軀、表皮、觸角、腹部、下唇須、下顎須、跗節(jié)和性腺等部位均有表達(dá)[14-16]。并且由于CSPs只有2個(gè)半胱氨酸組成的二硫鍵，它們能夠擴(kuò)大結(jié)合口袋來(lái)結(jié)合較大的蛋白質(zhì)，比如在鱗翅目害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)的研究中發(fā)現(xiàn)，HarmCSP4 與大分子物質(zhì)β-胡蘿卜素有很好的親和性[17]。這表明CSP 除了具有嗅覺(jué)的功能，還在昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)中發(fā)揮其他的功能。

2 化學(xué)感受蛋白的其他功能

2.1 信息素載體

CSPs 被認(rèn)為是信息素的載體。研究表明，部分CSPs作為第二類(lèi)的結(jié)合蛋白參與了化學(xué)信息的識(shí)別：（1）CSPs 在昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)感受器官中表達(dá)豐富，比如在沙漠蝗(Schistocerca gregaria)[18]、金龜子(Coleoptera scarabaeida)[19]。（2）它們能夠在微摩爾濃度下結(jié)合信息素，這點(diǎn)與OBP極其相似。尤其是蜜蜂的觸角特異性蛋白CSP3，能夠識(shí)別產(chǎn)卵信息素[20]。（3）有研究發(fā)現(xiàn)一些昆蟲(chóng)，比如胡蜂(Polistes dominulus)和阿根廷螞蟻(Linepithema humile)的CSPs 大部分種類(lèi)主要集中在觸角中表達(dá)。最近的研究表明，在RNA 水平，觸角中有特異性編碼CSPs的基因，這表明它們都參與了嗅覺(jué)的識(shí)別。

以上研究都表明了CSPs參與了昆蟲(chóng)嗅覺(jué)的識(shí)別，然而和OBPs 不同的是，沒(méi)有直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明CSPs在昆蟲(chóng)氣味識(shí)別的過(guò)程中發(fā)揮的作用。對(duì)OBPs的研究大多集中在如何探測(cè)性信息素方面。如把一種專(zhuān)一的信息素（性信息素對(duì)于果蠅和鱗翅目昆蟲(chóng)，報(bào)警信息素對(duì)于蚜蟲(chóng)）作為目標(biāo)，檢測(cè)特殊蛋白質(zhì)（受體和OBPs）對(duì)于專(zhuān)一信息素的反應(yīng)。對(duì)于CSPs而言，沒(méi)有廣泛存在的專(zhuān)一性信息。因此，單一CSP的存在或缺失，對(duì)于氣味的識(shí)別，不會(huì)產(chǎn)生主要的影響。然而，一些OBPs 與幾種信息素關(guān)聯(lián)在一起，對(duì)于CSPs 而言，有化學(xué)物質(zhì)識(shí)別的功能。另外有報(bào)道稱(chēng)，日本弓背蟻(Camponotus japonicus)的CSP能夠結(jié)合表皮的碳水化合物，能夠介導(dǎo)同伴的識(shí)別的功能[21]。

CSPs 在非嗅覺(jué)器官中存在。Jacquin-Joly 對(duì)甜菜夜蛾的研究表明，CSPMbraA6 和CSPMbraB1 在甜菜夜蛾的性腺中被鑒定出來(lái)。CSPMbraA6 在其觸角中被鑒定出來(lái)，CSPMbraB1 在喙中被鑒定出來(lái)[22]。在甜菜夜蛾的觸角和性腺的結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，放射性標(biāo)記性信息素都表現(xiàn)良好的結(jié)合特性。因此，結(jié)構(gòu)相似甚至是相同的CSPs行使雙重的角色，它既能夠在嗅覺(jué)器官中探測(cè)化學(xué)信息素，也能夠作為載體在分泌器官中釋放化學(xué)信息素。這類(lèi)的蛋白質(zhì)在果蠅的射精管中被鑒定出來(lái)，它參與了果蠅性信息素的釋放[23]。CSPs在性腺中起著溶解疏水信息素的作用，由性腺分泌并將它們釋放到環(huán)境中。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在鱗翅目昆蟲(chóng)的性腺中確認(rèn)編碼CSPs的基因，如斜紋夜蛾(Spodoptera litura)中發(fā)現(xiàn)SlitCSP3、SlitCSP14在性腺中高表達(dá)[24]，二化螟(Chilo suppressalis)組織表達(dá)譜CsupCSP2和CsupCSP10在性腺中高表達(dá)，[25]水稻大螟(Sesamia inferens)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到24 個(gè)CSP 基因，其中7 個(gè)(CSP2、CSP5、CSP6、CSP7、CSP16、CSP20、CSP23)在幼蟲(chóng)和性腺中高表達(dá)[26]。

眾所周知，蜜蜂擁有復(fù)雜的化學(xué)語(yǔ)言[27]，這些化學(xué)信號(hào)調(diào)節(jié)蜂王與工蜂的行為。一些信息素影響蜂群不同的方面。例如，蜂王的下顎信息素(QMP)能夠阻止工蜂產(chǎn)卵，而且通過(guò)工蜂調(diào)節(jié)幼蟲(chóng)的進(jìn)食，以及在交配飛行時(shí)作為性信息素。盡管信息素的釋放機(jī)制并沒(méi)有研究的很透徹，但有一點(diǎn)可以表明，釋放這些信息的化合物被結(jié)合蛋白結(jié)合在疏水性的口袋，能夠延長(zhǎng)它們的活性期并且還能防止被化學(xué)酶降解[28]。這也說(shuō)明腺體中的OBPs 和CSPs 能夠根據(jù)特定需求調(diào)節(jié)信息素混合物的成分構(gòu)成[29]。對(duì)昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，激活特定基因來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)更容易也很經(jīng)濟(jì)，而不是去合成信息素，因?yàn)檫@常需要另外一些酶的表達(dá)與發(fā)揮作用。對(duì)家蠶觸角的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，只發(fā)現(xiàn)了預(yù)測(cè)44種OBPs中的7種；預(yù)測(cè)的20種CSPs中的4種[30]。然而有7 種CSPs 在雌性性腺中有報(bào)道[30]。由于RNA 的可變剪切使得CSPs 出現(xiàn)非常多的變體（僅性腺中CSP1 的變體就有27種），在CSPs中有這么多高數(shù)量的變體可能與信息素的生物合成有關(guān)[31]。

OBPs 和CSPs 很可能參與了信息素的結(jié)合和釋放。Ejb-III 是在雄性的果蠅的精液中發(fā)現(xiàn)，它與雄性信息素有關(guān)。后來(lái)，根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，又在果蠅的精液中發(fā)現(xiàn)了另外5 種OBPs[32]。在蝗蟲(chóng)的雄性生殖器官中，含有大量的CSP(LmigCSP91)，并能夠與性腺中信息素有很好的結(jié)合特性。LmigCSP91 僅在雄性的性腺中有發(fā)現(xiàn)，在未交配的雌性性腺中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。但是交配后，雌性的生殖器官中也發(fā)現(xiàn)了LmigCSP91的存在。這表明，在交配的過(guò)程中用LmigCSP91作為性信息素的載體[33]。

2.2 抗藥性

近30年來(lái)，化學(xué)藥劑的大量使用的確對(duì)害蟲(chóng)的防控和糧食的增產(chǎn)起到了關(guān)鍵的作用。但是其負(fù)面的效果也不容小覷，如化學(xué)藥劑的使用破壞了環(huán)境，以及對(duì)天敵、非靶標(biāo)生物和人類(lèi)造成傷害。此外，害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性也是最嚴(yán)重的問(wèn)題之一。害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性后，就需要使用更大劑量甚至更多種類(lèi)的殺蟲(chóng)劑對(duì)其進(jìn)行防治。昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性的有以下原因：（1）殺蟲(chóng)劑在昆蟲(chóng)體內(nèi)的靶表基因發(fā)生突變；（2）昆蟲(chóng)體內(nèi)的效應(yīng)酶降解了殺蟲(chóng)劑分子；（3）害蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生與CSP表達(dá)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，用亞致死濃度的阿維菌素處理家蠶，一些CSP 蛋白會(huì)在家蠶的腹部表達(dá)顯著上調(diào)。與此相同，用亞致死濃度的煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑噻蟲(chóng)嗪處理白粉虱也得到同樣的結(jié)果[34]。CSPs在昆蟲(chóng)的腹中可能是一個(gè)緩沖的作用，能夠包裹有毒的殺蟲(chóng)劑分子，從而隨糞便排出體外。在小菜蛾的研究中，用菊酯類(lèi)農(nóng)藥處理后，小菜蛾發(fā)現(xiàn)有3 個(gè)CSP 蛋白（CSP4，CSP8 和CSP3）在頭部的表達(dá)上調(diào)[35]。殺蟲(chóng)劑處理后，昆蟲(chóng)化學(xué)感受蛋白基因的表達(dá)發(fā)生變化，這類(lèi)蛋白的變化與害蟲(chóng)的抗藥性如何相互影響，此機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

2.3 視覺(jué)色素的載體

Zhu 等[17]在棉鈴蟲(chóng)眼中發(fā)現(xiàn)了一些CSPs 蛋白，并且有些CSPs 蛋白在昆蟲(chóng)的喙中也有發(fā)現(xiàn)。這些CSP可能是作為與昆蟲(chóng)視覺(jué)相關(guān)的運(yùn)載體，穿過(guò)親水性的淋巴液。昆蟲(chóng)從食物中獲得的類(lèi)胡蘿卜素以及類(lèi)胡蘿卜素的降解產(chǎn)物3-羥基吲哚和3-羥基纈氨酸通過(guò)CSPs蛋白進(jìn)行運(yùn)輸，昆蟲(chóng)正是利用這2種降解產(chǎn)物作為視覺(jué)色素的，這不同于脊椎動(dòng)物的視覺(jué)色素——視黃醛、視黃醇。研究證明，也不僅僅只有一種CSP 蛋白作為視覺(jué)色素的運(yùn)載體，Wang等[36]在果蠅中發(fā)現(xiàn)了PINTA，包含了長(zhǎng)度273 個(gè)氨基酸的維生素A 結(jié)合蛋白和長(zhǎng)度為235 個(gè)氨基酸的維生素A 結(jié)合蛋白，并且在柑橘鳳蝶中也發(fā)現(xiàn)了相同的蛋白。這兩類(lèi)蛋白質(zhì)屬于不同的家族，與CSPs完全不相關(guān)。這可能和視覺(jué)的復(fù)雜機(jī)制有關(guān)，視覺(jué)色素的產(chǎn)生、運(yùn)輸和再循環(huán)可能需要一些不同功能蛋白的相互作用才可完成。

2.4 營(yíng)養(yǎng)

昆蟲(chóng)的CSPs蛋白在取食器官中高度表達(dá)[37]，并且有研究發(fā)現(xiàn)在昆蟲(chóng)取食的過(guò)程中發(fā)揮重要的功能，如疏水性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的增溶劑和昆蟲(chóng)用喙吸食營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)減少壓力的表面活性劑。

綠頭蒼蠅以腐爛的肉和脂肪酸為食，這對(duì)它們的繁衍是必不可少的元素。在甘藍(lán)夜蛾的喙中鑒定出幾種與探測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)的CSPs蛋白。另外，一些研究報(bào)道稱(chēng)在一些蛾類(lèi)或蝶類(lèi)的喙中有高濃度的CSP 分泌。并通過(guò)“drink-blot”方法分離出這類(lèi)的蛋白[38]。如果僅是為了氣味探測(cè)，不能解釋為何喙中有這么高濃度的CSPs 蛋白，盡管化學(xué)感受器官在喙的頂端部位。第一種假說(shuō)是CSPs蛋白作為表面活性劑減少昆蟲(chóng)吸食營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)的阻力。然而，從蛾類(lèi)到蝶類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育遠(yuǎn)緣物種的喙中CSPs蛋白的保守型上來(lái)看，除了具有表面活性劑的功能外，這些蛋白還可能具有更多特殊的功能。CSPs蛋白對(duì)胡蘿卜素的親和性表明在昆蟲(chóng)取食的過(guò)程中它們作為疏水性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解劑和運(yùn)載體[17]。

2.5 再生和發(fā)育

CSPs 蛋白參與昆蟲(chóng)的再生和發(fā)育。螳螂在若蟲(chóng)階段能夠再生斷掉的腿部，在這個(gè)過(guò)程中一種10 kDa的蛋白含量極速的上升，在恢復(fù)之后又回到原來(lái)的生理水平，隨后，編碼這個(gè)蛋白的基因被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)測(cè)序與發(fā)現(xiàn)的其他CSPs基因非常的類(lèi)似。第二，在蜜蜂的研究中發(fā)現(xiàn)，CSP5 對(duì)受精卵的發(fā)育有至關(guān)重要的作用，編碼這類(lèi)蛋白的基因，僅僅在雌性的卵巢和卵上發(fā)現(xiàn)，在其他的成蟲(chóng)或幼蟲(chóng)的任何身體部位都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)[39]。當(dāng)用RNAi 技術(shù)沉默這個(gè)基因的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，受精卵不能完全發(fā)育并且卵也不能孵化[40]。第三，對(duì)紅火蟻的研究中發(fā)現(xiàn)，CSP9參與了紅火蟻的發(fā)育過(guò)程[41]。對(duì)紅火蟻的CSP9與蜜蜂的CSP5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，它們屬于相鄰的分支。在紅火蟻發(fā)育的第3 個(gè)階段，編碼CSP9 的mRNA 表達(dá)水平達(dá)到最高。用RNAi 技術(shù)沉默這段基因后，影響了氨基酸的合成和其他新陳代謝途徑，使得表皮合成受阻并且影響到了蛻皮作用[41]。

3 結(jié)論

綜上所述，CSPs 蛋白不僅分布在昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)器官，也不只與氣味分子的的檢測(cè)和識(shí)別有關(guān)。CSPs 蛋白還分布在昆蟲(chóng)的其他器官，并具有不同的生理功能，比如與昆蟲(chóng)的發(fā)育和抗藥性相關(guān)。CSPs 蛋白參與昆蟲(chóng)體內(nèi)許多不同的生理活動(dòng)，使研究者能夠有一個(gè)合理的推斷：與它們不同功能相關(guān)的統(tǒng)一特征是CSPs 蛋白具有穩(wěn)定和緊湊的結(jié)構(gòu)，可以結(jié)合和溶解疏水性小分子。這些疏水性的小分子可能是性腺分泌的性信息素、乳脂類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、視覺(jué)相關(guān)的色素、能夠與殺蟲(chóng)劑分子結(jié)合從而增加昆蟲(chóng)的抗藥性或者運(yùn)輸與昆蟲(chóng)的發(fā)育相關(guān)的激素。因此，研究CSPs 蛋白參與害蟲(chóng)抗藥性的發(fā)生過(guò)程，對(duì)于減緩害蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生是一個(gè)新的切入點(diǎn)。并且，由于CSPs蛋白保守的結(jié)合位點(diǎn)和多變的結(jié)構(gòu)特征，利用分子對(duì)接技術(shù)篩選與CSPs蛋白高親和性的氣味分子，可以解決單一性信息素分子引誘效率低的問(wèn)題