李立群，徐淑兔，李春蓮

（西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

農(nóng)學(xué)類本科生《植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)》實(shí)驗(yàn)的目的，是讓學(xué)生應(yīng)用無性生殖的原理，掌握無菌條件下植物組織或細(xì)胞的脫分化、再分化及再生技術(shù)，進(jìn)而培養(yǎng)出完整植株，并會應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐[1]。要想得到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，外植體能形成愈傷或分化出小芽，成為繼代培養(yǎng)的穩(wěn)定材料，完成植株再生，最重要的因素是潔凈的試驗(yàn)環(huán)境、無菌無毒的實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)者嫻熟的操作技能和實(shí)驗(yàn)過程的無污染。本文具體分析了《植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)》實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備狀況及本科生實(shí)驗(yàn)過程存在的主要問題與現(xiàn)象，提出改進(jìn)措施。讓同學(xué)們真正掌握植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和無菌操作技術(shù)，克服實(shí)驗(yàn)過程的缺陷和不足，為今后遺傳轉(zhuǎn)化研究和組培工廠化生產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)設(shè)備的準(zhǔn)備

植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)性、操作性強(qiáng)，且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都是在無菌條件下進(jìn)行的。一方面，操作環(huán)境要達(dá)到無菌要求，另一方面操作過程要嚴(yán)格無污染。否則，將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若接種室、培養(yǎng)間環(huán)境衛(wèi)生不達(dá)標(biāo)、空氣不潔凈，潛藏真菌、細(xì)菌、病毒等微生物，就會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)環(huán)境被污染[2-4]，不能開展教學(xué)實(shí)驗(yàn)。所以，建立無菌環(huán)境、消滅環(huán)境污染是實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段的第一要?jiǎng)?wù)。

首先，實(shí)驗(yàn)室布局要合理。無菌操作室和培養(yǎng)室不僅要單獨(dú)設(shè)置，要與高壓滅菌室及實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室隔離開來。絕對禁止微生物、泥土和未穿實(shí)驗(yàn)服的人員隨意進(jìn)入。要隨手關(guān)門，防止外來雜菌的入侵。由于造成環(huán)境污染的各類真菌、細(xì)菌、病毒不易被發(fā)覺，較難控制，只能勤消毒、勤通風(fēng)及時(shí)控制。實(shí)驗(yàn)期間堅(jiān)持每天滅菌消毒，消滅細(xì)菌、真菌、病毒。用1∶200的巴斯消毒液擦拭實(shí)驗(yàn)臺、噴灑門窗及窗簾；1∶100的巴斯消毒液拖凈地板，消毒作用時(shí)間至少30 min，然后再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%的酒精噴灑室內(nèi)，使灰塵落地，防止微小塵粒飛揚(yáng)，然后紫外燈加紫外燈車移動照射30 min全方位殺菌消毒，消除空氣中氣溶膠中的病毒、細(xì)菌等有害成分，為實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備一個(gè)良好的環(huán)境。

超凈臺內(nèi)部環(huán)境不合格等于實(shí)驗(yàn)無效，所以，使用前先用巴斯液擦拭消毒，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精噴灑消毒，待干燥后開啟通風(fēng)裝置，紫外燈照射滅菌30 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后同樣要做這三步消毒，以防交叉污染。高壓滅菌容器使用前要徹底清洗，內(nèi)外桶要用酒精消毒，鍋底注入蒸餾水或純凈水，每周更換一次。及時(shí)檢查密封圈，若變形立即更換；按時(shí)效驗(yàn)安全閥、壓力表；并制定嚴(yán)格的滅菌操作制度，規(guī)范使用滅菌器，保證壓力容器工作狀態(tài)正常，達(dá)到良好的滅菌效果。

所有實(shí)驗(yàn)用品包括培養(yǎng)基母液、培養(yǎng)基、蒸餾水和培養(yǎng)瓶都要包扎后進(jìn)行高溫高壓滅菌，即121°或105p持續(xù)30 min，殺滅細(xì)菌和真菌；操作工具如鑷子、手術(shù)刀、解刨針等金屬器具初次實(shí)驗(yàn)前也要包扎好高壓滅菌，每次實(shí)驗(yàn)前用紅外消毒器400°干熱滅菌30 min。近幾年本實(shí)驗(yàn)室沒有發(fā)生過培養(yǎng)基污染的現(xiàn)象，這可能與內(nèi)環(huán)境清潔消毒到位，滅菌過程嚴(yán)格按規(guī)程操作有關(guān)。

2 外植體的選擇和消毒

實(shí)驗(yàn)過程中外植體滅茵操作直接影響實(shí)驗(yàn)操作的成效。外植體即實(shí)驗(yàn)材料的選擇是否合適、消毒的徹底與否皆至關(guān)重要[5]。的教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目涉及煙草、油菜、大豆、豌豆、甘薯、小麥、馬鈴薯、胡蘿卜、月季等植物，消毒方法和消毒時(shí)間都不一樣。其中，葉片、幼嫩莖芽、易消毒，用時(shí)短，接種易成功；后4種作物較難消毒徹底，如小麥種子有腹溝，尾部毛刷結(jié)構(gòu)，包藏的污染源較多，比煙草葉片多用一倍的時(shí)間也不一定能徹底去除雜菌。曾經(jīng)嘗試過僅用酒精擦拭室內(nèi)培養(yǎng)的煙草葉片，直接接入培養(yǎng)瓶竟然沒被污染，愈傷長勢非常好。有些馬鈴薯、胡蘿卜自身帶菌的情況比較多，外購時(shí)很難用肉眼辨別，一旦消毒殺菌不徹底，即使實(shí)驗(yàn)操作不污染也易死亡。例如做馬鈴薯塊莖、胡蘿卜形成層培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，買回看起來很干凈健康的原材料，盡管接種后無污染，也有的褐化、死亡現(xiàn)象。分析原因可能是由于材料自身帶菌，造成實(shí)驗(yàn)失敗。月季莖段枝條有毛刺、風(fēng)雨泥土污染嚴(yán)重，做月季莖段培養(yǎng)，即使選用幼嫩枝條也很難消毒，需要用毒性較高的升汞消毒20 min以上才能徹底消毒。所以，針對外植體選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間非常關(guān)鍵。多數(shù)植物外植體按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟對其進(jìn)行表面消毒即可。一般用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%的酒精消毒 30～60 min；2%～5%的次氯酸鈉溶液消毒 8～15 min，無菌水沖洗五六次即可接種，而有些外植體由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜或自帶內(nèi)生菌,為達(dá)到較好的滅菌效果，除需要進(jìn)行表面消毒外還需要其他增強(qiáng)措施，如抽濾滅菌、添加抗生素、使用多種消毒劑、延長消毒時(shí)間等。但是時(shí)間并非越長越好，消毒劑并非越強(qiáng)越好，組培實(shí)驗(yàn)既要注意防止材料受藥害，也要防止人身受毒害。

3 學(xué)生在實(shí)驗(yàn)操作中存在的問題

材料選擇固然重要，但是每次實(shí)驗(yàn)的核心工作是學(xué)生的操作。操作過程中個(gè)人衛(wèi)生差、操作不規(guī)范、接種工具消毒不徹底、材料選擇不當(dāng)，都會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行，對連續(xù)性綜合性實(shí)驗(yàn)是最大的障礙。

學(xué)生實(shí)驗(yàn)中常見現(xiàn)象有未穿工作服直接闖入接種室；手未消毒直接伸進(jìn)超凈臺，或?qū)嶒?yàn)中途將手伸出超凈臺拿工具入超凈臺；接種工具槍鑷子、解剖刀、剪刀、解刨針等器具在酒精燈上灼燒消毒后，未待冷卻就接種，燙傷實(shí)驗(yàn)材料；也有些人實(shí)驗(yàn)步驟不熟悉，操作程序顛倒，操作缺乏經(jīng)驗(yàn)等等，這些都是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的直接原因。無菌操作者的基本要求是個(gè)人衛(wèi)生良好，身穿工作服，帶著手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但本科生實(shí)驗(yàn)多數(shù)情況下是不帶手套的，因此，操作前必須自行消毒，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精消毒雙手和工作服袖口及正對超凈臺的前襟。雙手一旦伸進(jìn)的超凈臺后，不能隨意出來，否則就要重新消毒。即使帶了手套，也不能隨意接觸其他物品后不更換、不消毒就去做組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。例如，有同學(xué)做土壤微生物實(shí)驗(yàn)帶著手套，未消毒換手套又來做組培接種，結(jié)果其培養(yǎng)瓶中長滿黑毛，細(xì)菌污染相當(dāng)嚴(yán)重。

對植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，無菌操作技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)積累都是關(guān)鍵因素[6]。技術(shù)嫻熟的同學(xué)，無菌操作規(guī)范，接種不易污染，實(shí)驗(yàn)易成功。初次實(shí)驗(yàn)的同學(xué)，雖然小心翼翼，也容易做不好，實(shí)驗(yàn)污染率比有經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)高兩倍。學(xué)生初次配培養(yǎng)基經(jīng)常出現(xiàn)不凝固，接種出現(xiàn)污染現(xiàn)象就是缺少經(jīng)驗(yàn)，pH值未調(diào)好、無菌操作未掌握的原因。所以，在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備良好的情況下，學(xué)生的操作技能在整個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中起著決定性作用，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗。

4 針對實(shí)驗(yàn)中的問題采取有效措施

在控制《植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)》實(shí)驗(yàn)主要影響因素及提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能方面，采取積極有效的措施予以應(yīng)對。

首先，持之以恒地搞好日常維護(hù)，抑制環(huán)境污染。日常清潔、酒精、巴斯消毒必不可少。夏季氣溫較高環(huán)境污染嚴(yán)重時(shí)，還需要用甲醛和高錳酸鉀混合熏蒸實(shí)驗(yàn)室，為接種室和培養(yǎng)室殺菌，保持組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室潔凈無菌；對平時(shí)實(shí)驗(yàn)失敗污染的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等器具，嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)直接打開，必須經(jīng)高壓滅菌后，倒掉污染的培養(yǎng)基及外植體，然后再清洗干燥，防止真菌孢子在實(shí)驗(yàn)室飛舞蔓延，對以后實(shí)驗(yàn)環(huán)境造成二次污染[7]。對超凈臺，除了日常消毒，經(jīng)常檢測操作區(qū)帶菌量，定期清洗超凈臺抽濾網(wǎng)，達(dá)不到要求的及時(shí)更換，一般每3年更換1次。其他設(shè)備如培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架、搖床、離心機(jī)等設(shè)備，實(shí)驗(yàn)前嚴(yán)格用沸水、巴斯消毒液、酒精擦洗消毒，以防無菌操作無誤卻在培養(yǎng)過程中造成失誤，營造植物組織細(xì)胞分化、再生的良好環(huán)境。

其次，在材料準(zhǔn)備方面下功夫，認(rèn)真準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料，為減少大田取材污染重的影響，用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的大部分實(shí)驗(yàn)材料由實(shí)驗(yàn)人員親自在室內(nèi)種植，在植物生長最旺盛階段，選擇最健壯、最適合的部位作為培養(yǎng)對象；對于外來材料嚴(yán)格挑選，預(yù)培養(yǎng)檢測其是否自身帶病毒，保證選出優(yōu)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，盡量降低實(shí)驗(yàn)材料自身帶菌導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)失敗，盡可能讓學(xué)生在有限的時(shí)間內(nèi)掌握更多實(shí)驗(yàn)技能。同時(shí)還要及時(shí)總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，調(diào)整消毒方法，提高實(shí)驗(yàn)成功率。如小麥成熟胚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是農(nóng)學(xué)學(xué)生必做的實(shí)驗(yàn)，也是學(xué)生操作下最不易成功的實(shí)驗(yàn)，滅菌不徹底是主要因素。浸泡種子前反復(fù)淘洗、抽真空減壓消毒，再用雙氧水沖洗，之后用無菌水加2,4-D浸泡，接種前延長酒精和次氯酸鈉的消毒時(shí)間，增強(qiáng)滅菌效果，保證每次實(shí)驗(yàn)成功有效。

再次，建立無菌植株系統(tǒng)[8-9]，選擇煙草、油菜、馬鈴薯等作物，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取其葉或莖，從愈傷誘導(dǎo)—叢生芽分化—生根培養(yǎng)—煉苗移栽四大步，連續(xù)做綜合實(shí)驗(yàn)。選擇上一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為下一實(shí)驗(yàn)提供材料，系統(tǒng)性地完成植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的全過程，主動降低實(shí)驗(yàn)過程的污染率，提高操作效率。

最后，努力提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能和實(shí)踐水平。要求學(xué)生提前熟悉無菌操作規(guī)程及每個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)環(huán)節(jié)；實(shí)驗(yàn)前反復(fù)認(rèn)真觀看教師針對實(shí)驗(yàn)制作的操作視頻和現(xiàn)場演示；動手操作時(shí)仔細(xì)觀察接種物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，規(guī)范消毒，嚴(yán)格按步驟操作；培養(yǎng)階段要求學(xué)生3 d觀察一次，及時(shí)記錄外植體的變化；認(rèn)真分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)成功經(jīng)驗(yàn)、分析失敗原因。精心安排實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。針對32課時(shí)的實(shí)踐操作課程，先上單一性驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，讓同學(xué)們先訓(xùn)練基本技能，熟練掌握無菌操作技術(shù)，再進(jìn)行綜合性、創(chuàng)新性連續(xù)性實(shí)驗(yàn)操作，漸進(jìn)式學(xué)習(xí)實(shí)踐，進(jìn)一步提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平。這樣經(jīng)過反復(fù)體會、訓(xùn)練，練就嫻熟的技能，積累豐富的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和良好的教學(xué)效果。

5 結(jié)束語

雖然影響《植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)》實(shí)驗(yàn)的因素較多，但多數(shù)都是可以控制的。同學(xué)們通過學(xué)習(xí)實(shí)踐再學(xué)習(xí)，真正精湛地掌握了植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)這門專業(yè)技能，能夠獨(dú)立判斷分析實(shí)驗(yàn)成敗的原因，并能有效控制、清除實(shí)驗(yàn)污染，培育出再生植株，為今后嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲泄ぷ骱蜕a(chǎn)實(shí)踐打下良好的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果良好，得到老師、同學(xué)和就業(yè)單位的好評。