賀建蘭，李青峰，鐘 晶，畢 雷，尚鵬程，汪 波，邢 燕，羅 濤，王玥蓮，周 覓

成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心檢驗(yàn)科，四川成都 610061

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)已納入《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的乙類(lèi)傳染病，按甲類(lèi)傳染病管理,《新型冠狀病毒肺炎診療方案》(試行第七版)增加了抗體檢測(cè)的內(nèi)容，抗體檢測(cè)在COVID-19診療過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[1-6]。因此，血清新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)特異性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)抗體檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性對(duì)疾病的診斷、治療至關(guān)重要。本研究擬對(duì)COVID-19確診病例使用不同類(lèi)型標(biāo)本的特異性IgM和IgG抗體檢測(cè)效力進(jìn)行了初步探討，并分析了標(biāo)本凍存對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年2—3月在成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心住院的COVID-19確診病例58例，男33例，女25例，年齡29～88歲。將入選患者分為兩部分，其中20例用于比較血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體水平，收集其入院當(dāng)日同源血清、血漿標(biāo)本20份，檢測(cè)SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體的S/CO值；其余38例于入院當(dāng)日采集靜脈血并檢測(cè)血清SARS-CoV-2 特異性IgG抗體，然后于-80 ℃冰箱保存，并于2020年3月取出血液標(biāo)本，于室溫下復(fù)溶，充分混勻后上機(jī)檢測(cè)，期間無(wú)反復(fù)凍融。比較凍存前后血清IgG抗體水平差異。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2研究方法 采用磁微粒和化學(xué)發(fā)光技術(shù)，按照間接法原理進(jìn)行免疫檢測(cè)。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)貝克曼Access2)、試劑盒購(gòu)自四川沃文特生物技術(shù)有限公司。首先將血清或血漿標(biāo)本、分析緩沖液、生物素化的SARS-CoV-2抗原包被的鏈親和素磁珠及堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的鼠抗人IgM/IgG抗體加入反應(yīng)管中孵育，形成“免疫磁珠-SARS-CoV-2 IgG抗體-酶結(jié)合物”復(fù)合物，再通過(guò)洗滌，將未被結(jié)合的酶結(jié)合物及其他物質(zhì)去除。然后，加入發(fā)光底物(AMPPD)，酶結(jié)合物催化發(fā)光底物發(fā)射光子，光子的數(shù)量與標(biāo)本中SARS-CoV-2 特異性IgM和IgG抗體水平呈正相關(guān)。

1.3標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象均采集空腹靜脈血5 mL，分別置于含分離膠和含枸櫞酸鹽的采血管內(nèi)，靜置待血液凝固，2 500×g離心5 min分離血漿。分別收集血清或血漿備用。

1.4SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測(cè) SARS-CoV-2 特異性IgM和IgG抗體檢測(cè)遵照化學(xué)發(fā)光免疫分析儀操作指南。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀器根據(jù)校準(zhǔn)品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)自動(dòng)計(jì)算陽(yáng)性判斷值(cut-off值)。陰性(-)：S/CO值<1.00，待檢標(biāo)本中未檢出SARS-CoV-2 特異性IgM或IgG抗體；陽(yáng)性(+)：S/CO值≥1.00，待檢標(biāo)本中檢出SARS-CoV-2特異性IgM或 IgG抗體。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體S/CO值采用秩和檢驗(yàn),非正態(tài)分布資料以M(P25～P75)表示；變量間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1COVID-19確診患者同源血清與血漿IgM和IgG抗體S/CO值比較 Spearman相關(guān)性分析顯示，血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgM抗體相關(guān)系數(shù)(r)=0.999 6，SARS-CoV-2特異性IgG抗體r=0.976 7，SARS-CoV-2特異性IgM抗體擬合線斜率為1.060(95%CI：1.045～1.068)，SARS-CoV-2特異性IgG抗體擬合線斜率為1.086(95%CI：1.011～1.161)，提示血清和血漿的S/CO值均呈線性相關(guān)，見(jiàn)圖1。血漿 SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體的S/CO值均略高于血清。血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgM抗體的S/CO值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 2)；血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgG抗體的S/CO值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005 6)。血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)相同，配對(duì)結(jié)果一致，表明該差異并不影響定性結(jié)果判讀，定性分析結(jié)果也相同，見(jiàn)表1。

注：A為血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgM抗體的 S/CO值關(guān)系分析；B為血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgG 抗體的S/CO關(guān)系分析。

表1 血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體的S/CO值分析及定性結(jié)果

2.2凍存前后標(biāo)本SARS-CoV-2特異性IgG抗體S/CO值關(guān)系分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，凍存前后標(biāo)本SARS-CoV-2特異性IgG抗體的S/CO值具有相關(guān)性(r=0.984 5，P<0.05)，斜率僅為0.748 1(95%CI：0.711 9～0.784 3)，見(jiàn)圖2。同時(shí)，定性分析中也出現(xiàn)2例標(biāo)本在凍存前SARS-CoV-2特異性IgG抗體檢測(cè)為陽(yáng)性，而在凍存后SARS-CoV-2特異性IgG抗體檢測(cè)為陰性。

圖2 凍存前后血清標(biāo)本SARS-CoV-2特異性IgG抗體的S/CO值關(guān)系分析

3 討 論

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》針對(duì)COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)新增了如下內(nèi)容：(1)確診病例第三條血清SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體陽(yáng)性，血清SARS-CoV-2特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性或恢復(fù)期較急性期4倍及以上升高；(2)COVID-19疑似病例排除標(biāo)準(zhǔn)為疑似病例連續(xù)2次呼吸道病原核酸檢測(cè)陰性(采樣時(shí)間至少間隔24 h)，且發(fā)病7 d后SARS-CoV-2特異性抗體IgM和IgG抗體仍為陰性[6]。有研究表明，IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)對(duì)COVID-19的診斷、療效固體及預(yù)后均具有價(jià)值[7-10]。徐萬(wàn)洲等[11]研究表明，血清SARS-CoV-2 特異性IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)可作為SARS-CoV-2感染的有效篩查和診斷指標(biāo)，是COVID-19核酸檢測(cè)假陰性的有效補(bǔ)充。唐鵬等[12]研究比較了化學(xué)發(fā)光和膠體金法檢測(cè)SARS-CoV-2特異性抗體的陽(yáng)性檢測(cè)值等，提出在COVID-19的診療過(guò)程中，抗體的檢測(cè)可以輔助彌補(bǔ)咽拭子核酸檢測(cè)的不足，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定總抗體優(yōu)于膠體金法。

在對(duì)SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測(cè)時(shí)，除了需要選擇靈敏度和特異度較好的檢測(cè)試劑盒外，標(biāo)本類(lèi)型也非常重要[13-15]。有研究表明，在登革熱病毒的檢測(cè)中，血清和血漿標(biāo)本同樣有效[8]。本研究通過(guò)比對(duì)COVID-19確診患者同源血清與血漿SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體S/CO發(fā)現(xiàn)，血清和血漿SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體均存在高度相關(guān)性，擬合線斜率接近1.0，且定性分析結(jié)果完全一致。本研究結(jié)果表明，血清和血漿標(biāo)本具有同樣的檢測(cè)效力，但需要注意的是，血清和血漿標(biāo)本SARS-CoV-2特異性IgM抗體存在一定差異，盡管在本研究中并未影響定性分析，但在大樣本量的臨床實(shí)踐中仍有出現(xiàn)差異的可能，差異原因有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，即使在-80 ℃凍存，且避免反復(fù)凍融的理想情況下，僅僅保存3周，標(biāo)本S/CO明顯下降且有2個(gè)標(biāo)本出現(xiàn)了定性分析的偏差。因此，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)盡量選擇新鮮血液標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2特異性IgM和IgG抗體檢測(cè)。