常睿珩，許康豪，蔡雨珊，楊金龍、2，梁簫、2*

(1.上海海洋大學(xué) 國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州),廣東 廣州 511458)

生物被膜是附著在物體外側(cè)或相互接觸面的具備結(jié)構(gòu)的微生物群體[1]，由微生物及其分泌的胞外基質(zhì)組成，為順應(yīng)生活環(huán)境而形成在活性或惰性材質(zhì)外層[2]。在水體環(huán)境中，絕大部分固體附著基質(zhì)的表層都存在著生物被膜。細(xì)菌附著到基質(zhì)表層并產(chǎn)生胞外產(chǎn)物形成了生物被膜，這是生物被膜形成的重要部分[3]。影響生物被膜形成的因素有很多，如溫度和鹽度[4]、培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽[5]、不同種細(xì)菌[6]等。生物被膜能影響貽貝、藤壺等幼蟲的附著變態(tài)[7-9]，該現(xiàn)象是海洋經(jīng)濟(jì)貝類養(yǎng)殖和海洋防污損的研究熱點(diǎn)。

鈣離子是高度通用的細(xì)胞內(nèi)信號，可以調(diào)節(jié)多種不同細(xì)胞的功能[10]。在海洋環(huán)境中，鈣是一種經(jīng)常在物體表面富集的元素，既可以是沉積的鈣沉積物，也可以與其他海洋生物結(jié)合在一起[11]。鈣能影響生物被膜的形成，特別是鈣參與了細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性和非特異性相互作用[12-13]。已有試驗(yàn)證實(shí)，鈣離子能夠促進(jìn)大腸桿菌生物被膜和銅綠假單胞菌生物被膜形成[14-15]，抑制霍亂弧菌生物被膜形成[16]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用海假交替單胞菌Pseudoalteromonasmarina(ECSMB14103) 為上海海洋大學(xué)貝類分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(以下簡稱本實(shí)驗(yàn)室)的保種菌株(保藏號為MCCC 1K03544)。該菌株來自浙江省嵊泗縣枸杞島(122°46′E、30°43′N)的自然生物被膜表面，使用Zobell 2216E平板劃線進(jìn)行培育，再分離菌株得到單一菌株，利用甘油-生理鹽水保種液保種，在-80 ℃超低溫冰箱中保存。

自然海水(nature seawater,NSW)取自浙江省嵊泗縣枸杞島附近，經(jīng)測定鈣離子濃度為11.78 mmol/L。考慮到要調(diào)節(jié)海水中的鈣離子含量，用自然海水無法減少其中鈣離子的含量，故本試驗(yàn)中配制與自然海水成分最為相似的人工海水(artificial seawater，ASW)，以此來達(dá)到人為調(diào)控海水鈣離子濃度的目的。試驗(yàn)設(shè)置鈣離子濃度為10 mmol/L的對照組，以及鈣離子濃度為0、1、5、20、50 mmol/L的5個(gè)試驗(yàn)組。人工海水的配方如下：蒸餾水、NaCl、MgSO4·7H2O、MgCl2·6H2O、KCl、CaCl2、NaNO3、K3PO4、β-五水甘油磷酸二鈉鹽、Na2SiO3·9H2O、維生素、pⅡMetals、S2Metals、Tris、氨基三乙酸。

試驗(yàn)用厚殼貽貝稚貝取自浙江省舟山市嵊泗縣(122°46′E、30°69′N)，在本實(shí)驗(yàn)室用自然海水暫養(yǎng)一周后使用。挑選殼長為(0.56±0.03)mm、殼高為(0.38 ± 0.02)mm的稚貝用于附著試驗(yàn)。

試驗(yàn)用激光共聚焦顯微鏡由Leica公司生產(chǎn)(×630倍鏡)。

1.2 方法

1.2.1 海假交替單胞菌的分離 參考Yang等[17]的方法，將附著在載玻片上的自然生物被膜(浙江省嵊泗縣枸杞島)從載玻片表面刮到過濾過的海水中，將混有細(xì)菌的海水均勻涂在Zobell 2216E平板上，平板倒置在溫度25 ℃且黑暗的條件下培育48 h，從中挑取目的菌落。再將選取出來的菌株反復(fù)分離純化，最后將確定的純種海假交替單胞菌(經(jīng)Adapt Noise Immunity分析，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)用0.9%生理鹽水配制成30%的甘油保種液保種，再放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 生物被膜的制備 參考Yang等[17]的方法，用Zobell 2216E液體培養(yǎng)基培育純種海假交替單胞菌，在25 ℃、黑暗條件下擴(kuò)大培育16 h。用無菌海水洗滌培養(yǎng)的菌液3次，最后定容至50 mL懸濁菌液。使用Olympus BX-51熒光顯微鏡確定菌液細(xì)胞密度并在培養(yǎng)皿(直徑64 mm×19 mm)中加入相應(yīng)的菌液，再加入無菌海水使得培養(yǎng)皿終體積為20 mL。在18 ℃、黑暗條件下培育48 h形成試驗(yàn)用生物被膜。

菌液的初始細(xì)胞密度分別設(shè)定為1×106、1×107、1×108、5×108cells/mL，自然海水(NSW)與人工海水(ASW)形成生物被膜的比較試驗(yàn)中使用這4組密度，其余試驗(yàn)均選用最佳密度1×108cells/mL。

1.2.3 生物被膜細(xì)菌密度的計(jì)算 參考Yang等[17]的方法，將5%福爾馬林溶液固定過的生物被膜用0.1%的吖啶橙溶液染色5 min后，晾干制片，在1 000倍熒光顯微鏡(Olympus BX-51)下選擇30個(gè)區(qū)域計(jì)算細(xì)菌個(gè)數(shù)。計(jì)算公式為

時(shí)代向中國畫家提出一個(gè)艱巨的歷史課題：要在人物畫創(chuàng)作上突破傳統(tǒng)的觀念、創(chuàng)作模式和表現(xiàn)技法，直接面向現(xiàn)代，表現(xiàn)現(xiàn)實(shí)生活。

生物被膜細(xì)胞密度(cells/cm2)=區(qū)域內(nèi)細(xì)菌數(shù)(cells)/(區(qū)域個(gè)數(shù)×區(qū)域面積10-4cm2)。

1.2.4 厚殼貽貝稚貝附著試驗(yàn) 在培養(yǎng)皿中加入載有生物被膜的玻片，加入20 mL滅菌海水，放入10枚稚貝，每組設(shè)9個(gè)重復(fù)。在18 ℃、黑暗環(huán)境下培育，依據(jù)放入稚貝的時(shí)間分別觀察12、24、48 h的附著情況，并計(jì)算附著率(%)，即

附著率=載玻片上附著個(gè)數(shù)/總稚貝數(shù)×100%。

因12、24、48 h附著率結(jié)果基本相似，故本試驗(yàn)中僅出示24 h時(shí)的附著率結(jié)果。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡標(biāo)本染色 參考González-Machado等[18]的方法，用表1的染料進(jìn)行共聚焦避光染色，染色20 min，染色前后分別用0.9%生理鹽水清洗生物被膜，并計(jì)算生物量體積(μm3)，即

生物量體積=生物量總面積(Image J軟件處理)×層厚0.2 μm。

表1 激光共聚焦顯微鏡標(biāo)本染料成分及染色對象Tab.1 Dye composition and targets for confocal laser scanning microscopy

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均使用JMP 10.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及相關(guān)性檢驗(yàn)。在統(tǒng)計(jì)分析前，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢測，滿足正態(tài)分布，則使用單因素方差分析。通過多元分析方法驗(yàn)證稚貝附著率和鈣離子濃度與細(xì)菌密度、膜厚、胞外產(chǎn)物生物量之間是否具有相關(guān)性，顯著性水平設(shè)為0.05。用Image J軟件處理共聚焦圖像，計(jì)算胞外產(chǎn)物共聚焦的面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然海水和人工海水形成的生物被膜細(xì)菌密度及稚貝附著率

從圖1A可見：在初始菌液濃度為1×106cells/mL條件下，自然海水形成的生物被膜細(xì)菌密度為1.24×106cells/cm2，人工海水形成的生物被膜細(xì)菌密度為1.19×106cells/cm2，二者間無顯著性差異(P>0.05)；隨著初始菌液密度的增加，自然海水和人工海水培養(yǎng)的生物被膜的細(xì)菌最終密度均呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(P<0.05)，且二者間終密度并無顯著性差異(P>0.05)。

從圖1B可見：初始菌液密度為1×106、1×107cells/mL條件下，加入稚貝24 h后自然海水和人工海水培養(yǎng)的生物被膜誘導(dǎo)的厚殼貽貝稚貝附著率與空白組的稚貝附著率(13.33%)相比，均無顯著性差異(P>0.05)；在初始菌液濃度為1×108cells/mL條件下，自然海水生物被膜的稚貝附著率為35.56%，人工海水生物被膜的稚貝附著率為36.67%，均顯著高于前兩個(gè)初始密度組(P<0.05)，但自然海水與人工海水兩組間稚貝附著率并無顯著性差異(P>0.05)；在初始菌液密度為5×108cells/mL條件下，自然海水和人工海水兩組間稚貝附著率并無明顯差異(P>0.05)，且與1×108cells/mL密度組也無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 不同鈣離子濃度下生物被膜的細(xì)菌密度

從圖2可見：人工海水形成的生物被膜在菌液初始密度全部為1×108cells/mL時(shí)，海假交替單胞菌生物被膜的細(xì)菌終密度在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)最高，為2.53×107cells/cm2；當(dāng)鈣離子濃度升高或降低時(shí)，生物被膜的終密度分別呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)，鈣離子濃度為50 mmol/L時(shí)生物被膜的細(xì)菌終密度最低，僅為1.63×107cells/cm2。

2.3 不同鈣離子濃度下生物被膜的稚貝附著率

從圖3可見：人工海水形成的生物被膜在菌液初始密度為1×108cells/mL條件下，加入稚貝24 h后，在鈣離子濃度為0、1 mmol/L時(shí)，稚貝附著率均為22.22%，與空白對照相比并無明顯差異(P>0.05)；隨著鈣離子濃度增加，稚貝附著率也呈現(xiàn)上升趨勢，在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)稚貝附著率達(dá)到最大值(35.56%)，隨后稚貝附著率開始下降，在鈣離子濃度為50 mmol/L時(shí)稚貝附著率僅為23.33%。

2.4 不同鈣離子濃度下生物被膜的形態(tài)與厚度

通過用共聚焦顯微鏡對不同鈣離子濃度下培養(yǎng)48 h的海假交替單胞菌生物被膜上細(xì)菌的分布形態(tài)進(jìn)行觀察(圖4A)，在鈣離子濃度為0 mmol/L時(shí)，細(xì)菌的分布最為稀疏，膜厚也較薄，僅有4.00 μm；當(dāng)鈣離子濃度增加到10 mmol/L時(shí)，細(xì)菌開始聚集，細(xì)菌密度逐漸增加，此時(shí)膜厚達(dá)到最大值，為5.62 μm；當(dāng)鈣離子濃度增加到50 mmol/L時(shí)，細(xì)菌數(shù)量逐漸減少至稀疏的狀態(tài)，生物被膜的厚度呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(P<0.05)(圖4B)。

2.5 不同鈣離子濃度對生物被膜胞外多糖的影響

通過共聚焦顯微鏡觀察不同鈣離子濃度下培養(yǎng)48 h的生物被膜的胞外多糖(圖5A、圖6A)，海假交替單胞菌生物被膜的胞外α多糖和β多糖的生物量在鈣離子濃度為0 mmol/L時(shí)最少，分別為32.28、34.55 μm3；在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)，胞外多糖的生物量增加至最多，其中胞外α多糖的生物量為258.35 μm3，胞外β多糖的生物量為174.74 μm3；隨著鈣離子濃度繼續(xù)升高，生物被膜的胞外多糖生物量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)(圖5B、圖6B)。

2.6 不同鈣離子濃度對生物被膜胞外蛋白的影響

通過共聚焦顯微鏡觀察不同鈣離子濃度下培養(yǎng)48 h的生物被膜的胞外蛋白(圖7A)，海假交替單胞菌生物被膜胞外蛋白的生物量在鈣離子濃度為0 mmol/L時(shí)最少，為117.47 μm3；在鈣離子濃度為 10 mmol/L時(shí)，胞外蛋白的生物量升高至最多，為334.15 μm3；隨著鈣離子濃度繼續(xù)升高，生物被膜的胞外蛋白生物量呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P<0.05)，并且除鈣離子濃度為10 mmol/L外，其余濃度下生物量均無顯著性差異(P>0.05)(圖7B)。

2.7 不同鈣離子濃度對生物被膜胞外脂類的影響

通過共聚焦顯微鏡觀察不同鈣離子濃度下培養(yǎng)48 h生物被膜的胞外脂類(圖8A)，海假交替單胞菌生物被膜胞外脂類的生物量在鈣離子濃度為0 mmol/L時(shí)最少，僅為11.52 μm3；在鈣離子濃度10 mmol/L時(shí)，胞外脂類的生物量上升至最多，為22.02 μm3；隨著鈣離子濃度的繼續(xù)升高，生物被膜的胞外脂類生物量呈顯著下降趨勢(P<0.05)，并且除鈣離子濃度為10 mmol/L外，其余濃度下的生物量均無顯著性差異(P>0.05)(圖8B)。

2.8 相關(guān)性分析

從表2可見：稚貝附著率與生物被膜細(xì)菌密度、膜厚、胞外多糖和胞外蛋白呈顯著相關(guān)(P<0.05)；鈣離子濃度僅與生物被膜膜厚呈顯著相關(guān)(P<0.05),與其他因子均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表2 生物被膜生物學(xué)特征與稚貝附著率、鈣離子濃度的相關(guān)性分析

3 討論

低鈣離子濃度能顯著誘導(dǎo)莫桑比克羅非魚的黏液細(xì)胞增殖，以抵抗外界脅迫[19]。同時(shí)，鈣離子濃度能顯著影響三角帆蚌的生長[20]。但是，目前尚未有試驗(yàn)驗(yàn)證鈣離子濃度對海假交替單胞菌生物被膜和厚殼貽貝稚貝附著的影響。

3.1 自然海水和人工海水的比較

由于本試驗(yàn)中要研究鈣離子濃度變化對海假交替單胞菌生物被膜和稚貝附著的影響，需要調(diào)節(jié)鈣離子的濃度，故使用人工海水來調(diào)節(jié)鈣離子濃度。與自然海水相比較，本試驗(yàn)中使用的人工海水在培養(yǎng)4個(gè)不同初始菌液密度下的海假交替單胞菌生物被膜形成中未產(chǎn)生任何顯著性影響。在4個(gè)不同初始菌液密度下，人工海水培養(yǎng)的細(xì)菌生物被膜的細(xì)菌密度與自然海水培養(yǎng)的生物被膜相比無顯著性的差異，兩種海水分別培養(yǎng)的細(xì)菌生物被膜對稚貝附著的誘導(dǎo)活性也均無顯著性差異。多次重復(fù)試驗(yàn)所得到的結(jié)果相同，表明該人工海水對于細(xì)菌生物被膜的形成具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性。說明該人工海水可用于本試驗(yàn)中替代自然海水進(jìn)行試驗(yàn)。另一方面，人類活動會造成海水中氮元素、磷元素和石油類物質(zhì)超標(biāo)等污染問題[21]，海水養(yǎng)殖的品質(zhì)和效益受到海水水體污染影響，海洋環(huán)境污染會導(dǎo)致養(yǎng)殖品種的質(zhì)量降低。因此，未來可以考慮使用人工海水替代天然海水進(jìn)行陸基人工養(yǎng)殖。

3.2 不同鈣離子濃度對生物被膜形成的影響

通過試驗(yàn)可以觀察到生物被膜細(xì)菌密度和生物被膜厚度在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)達(dá)到最大值，而在其他鈣離子濃度下均降低。依據(jù)共聚焦顯微鏡拍攝結(jié)果觀察，生物被膜在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)細(xì)菌呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，在其余鈣離子濃度下細(xì)菌分散且密度減少，生物被膜形成能力變差。對假交替單胞菌Pseudoalteromonassp.的研究也有相似的結(jié)果，在鈣離子濃度為10 mmol/L時(shí)，Pseudoalteromonassp.生物被膜最厚，在其余濃度下生物被膜厚度均降低[11]，該試驗(yàn)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

本研究中，依據(jù)相關(guān)性分析，鈣離子濃度僅與生物被膜膜厚顯著相關(guān)，生物被膜膜厚受到胞外產(chǎn)物生物量的影響。生物被膜的形成是連續(xù)的進(jìn)程，通過浮游細(xì)菌附著到表面上，然后形成生物被膜，其中細(xì)菌被包埋在由核酸、蛋白質(zhì)和多糖組成的基質(zhì)中[22-24]。在生物被膜中生長的細(xì)菌產(chǎn)生一種或多種胞外產(chǎn)物，它們會充當(dāng)支架，將生物被膜群落的細(xì)菌維持在一起；多糖是生物被膜基質(zhì)的主要組分，其有助于生物被膜的整體結(jié)構(gòu)及抗性[23, 25-26]。鈣離子對微生物各方面的影響，最終主要體現(xiàn)在生物被膜及其胞外產(chǎn)物的變化上[27]。在本試驗(yàn)中，將培養(yǎng)48 h的胞外產(chǎn)物進(jìn)行共聚焦顯微鏡拍攝，以驗(yàn)證鈣離子是否也影響胞外產(chǎn)物。生物被膜的3種胞外產(chǎn)物包括多糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，多糖和蛋白質(zhì)在胞外產(chǎn)物中占主導(dǎo)地位。在鈣離子濃度10 mmol/L時(shí)，海假交替單胞菌生物被膜形成的胞外產(chǎn)物最多，而在其余濃度下，胞外產(chǎn)物減少。這些試驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)，過高或過低的鈣離子濃度均能影響生物被膜的形成。

3.3 不同鈣離子濃度培養(yǎng)的生物被膜對厚殼貽貝稚貝附著的影響

許多海洋無脊椎動物幼蟲的附著變態(tài)可以被生物被膜影響[7]。皺紋和半透明兩個(gè)突變菌形成的假交替單胞菌生物被膜誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)的活性顯著降低，這表明具有較強(qiáng)的防污損能力[28]。本試驗(yàn)中，除10 mmol/L鈣離子濃度以外，其他鈣離子濃度培養(yǎng)的海假交替單胞菌生物被膜均抑制了厚殼貽貝稚貝的附著，即增加或減少鈣離子濃度，形成的生物被膜均可以減少稚貝的附著。

依據(jù)相關(guān)性分析，稚貝附著率與生物被膜密度、膜厚、胞外多糖和胞外蛋白顯著相關(guān)。參考Yang等[17]的方法，希瓦氏菌會促進(jìn)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)，可能與其釋放的信號分子和胞外產(chǎn)物有關(guān)。胞外產(chǎn)物主要是多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，其提供了生物被膜的機(jī)械穩(wěn)定性，介導(dǎo)了與表面的黏附，構(gòu)成了一個(gè)內(nèi)聚的三維聚合物網(wǎng)絡(luò)[29]。生物被膜的胞外產(chǎn)物在除10 mmol/L鈣離子濃度以外的其他濃度下均減少，與稚貝附著率的變化趨勢一致，胞外產(chǎn)物的減少與稚貝附著率的減少有一定相關(guān)性。

對Pseudoalteromonassp.的研究發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L鈣離子濃度導(dǎo)致其鞭毛蛋白表達(dá)量減少，外膜蛋白表達(dá)量增加，生物被膜形成能力增強(qiáng)[11]。大腸桿菌外膜蛋白OmpA已被證明可以結(jié)合非生物表面，OmpA在非生物表面上的生物被膜形成中起作用[30]。大腸桿菌ompA基因缺失突變菌形成的生物被膜厚度大大降低[31]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果推測，鈣離子可能影響了海假交替單胞菌外膜蛋白的表達(dá)量，從而抑制了胞外產(chǎn)物的分泌，進(jìn)而影響了生物被膜的形成和稚貝附著。

4 結(jié)論

1)鈣離子濃度高于或低于與自然海水最接近的濃度10 mmol/L時(shí)，均抑制了海假交替單胞菌生物被膜的形成。

2)過高或過低鈣離子濃度抑制了生物被膜密度、膜厚的形成，以及胞外多糖、胞外蛋白的分泌，進(jìn)而抑制了厚殼貽貝稚貝的附著。