李樹斌，劉 剛，戴雁峰

（內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010020）

哺乳動(dòng)物大多數(shù)組織中存在干細(xì)胞，干細(xì)胞因具有自我更新及分化潛能通常參與器官組織的修復(fù)和重建。哺乳動(dòng)物的睪丸存在精原干細(xì)胞（spermatogenic stem cells，SSCs），精原干細(xì)胞源源不斷地分化形成精子，維持雄性哺乳動(dòng)物一生的精子發(fā)生。幾十年來，傳統(tǒng)生殖生物學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為哺乳動(dòng)物一出生，其卵巢含有數(shù)量一定的原始卵泡，隨著卵巢的發(fā)育，卵母細(xì)胞經(jīng)歷排卵、凋亡，數(shù)量不斷減少直至消耗殆盡。然而，在2004年J.Johnson等［1］首次發(fā)現(xiàn)卵巢中存在有絲分裂活性的生殖干細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了長(zhǎng)達(dá)半個(gè)世紀(jì)的雌性哺乳動(dòng)物配子發(fā)生學(xué)說。2009年Zou K.等［2］利用抗原抗體特異反應(yīng)篩選表達(dá)Ddx4蛋白細(xì)胞，從小鼠卵巢內(nèi)分離獲得了卵原干細(xì)胞（OSCs），這些細(xì)胞可以在體外持續(xù)增殖，表達(dá)生殖干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Ddx4、Oct4、Stella、Prdm1等，將體外培養(yǎng)的OSCs移植到免疫缺陷的雌性小鼠卵巢中，OSCs可在體內(nèi)卵巢分化形成卵母細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)將OSCs的研究推向一個(gè)新階段。

1 卵子的產(chǎn)生

1.1 卵原細(xì)胞的產(chǎn)生

關(guān)于哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)生機(jī)制的研究主要集中于小鼠。小鼠的原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs）來源于上胚層（epiplast）細(xì)胞［3－4］。胚胎發(fā)育至6.5 dpc時(shí)，在上胚層細(xì)胞分泌的BMP4等生長(zhǎng)因子的作用下，PGCs前體細(xì)胞由上胚層后部遷移至尿囊基底部［3－4］，在尿囊基底部分化形成PGCs，PGCs通過重編程，開始表達(dá)PGCs特異化的轉(zhuǎn)錄因子Prdm1和Prdm14［5－6］。當(dāng)胚胎發(fā)育至10.5～11.5 dpc，PGCs通過后腸遷移至生殖嵴［7］。在這個(gè)遷移過程中，PGCs開始表達(dá)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，基因組DNA去甲基化［5］，X染色體再次被激活，同時(shí)組蛋白的修飾也發(fā)生顯著變化。PGCs遷移到達(dá)生殖嵴后，PGCs開始下調(diào)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，PGCs逐漸分化形成胚胎生殖干細(xì)胞（embryonic germ cells，EGCs）［8］。

1.2 原始卵泡的形成

EGCs在生殖嵴內(nèi)通過有絲分裂進(jìn)行有限的細(xì)胞增殖，通常增殖發(fā)生在胚胎發(fā)育的13.5～15.5 dpc，這些細(xì)胞在細(xì)胞分裂時(shí)發(fā)生不完全細(xì)胞分裂，細(xì)胞間通過橋狀結(jié)構(gòu)相連接（intercellular bridge），由細(xì)胞間橋相連的細(xì)胞團(tuán)聚合成簇，形成生殖細(xì)胞巢（germ cell nest）［9］。生殖細(xì)胞巢外面由卵巢索細(xì)胞包圍，生殖細(xì)胞巢內(nèi)的細(xì)胞稱之為卵原細(xì)胞［10］。生殖細(xì)胞巢內(nèi)細(xì)胞間可通過連接的橋狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行大分子輸送［11］，使某些卵原細(xì)胞獲得發(fā)育的特權(quán)［12］，卵原細(xì)胞也可能通過間橋連接進(jìn)行減數(shù)分裂細(xì)胞周期的同期化［13］。

在脊椎動(dòng)物，形成生殖細(xì)胞巢是生殖細(xì)胞發(fā)生的普遍現(xiàn)象［13］。但是除了對(duì)果蠅生殖細(xì)胞巢的形成和破裂有較多的研究外，目前人們對(duì)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞巢的形成和功能了解甚少。最近的研究發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞通過Dazl調(diào)控Tex14 mRNA的翻譯，控制生殖細(xì)胞巢內(nèi)細(xì)胞間橋的斷裂［14］。Tex14是構(gòu)成生殖巢細(xì)胞間橋的蛋白之一，在睪丸中Tex14 mRNA與Dazl蛋白共沉淀，Dazl通過與Tex14 mRNA的3′UTR結(jié)合，調(diào)控Tex14的翻譯。生殖細(xì)胞表達(dá)Dazl是獲得應(yīng)答視黃酸（retinoic acid，RA）從而進(jìn)入減數(shù)分裂的關(guān)鍵蛋白，抑制Dazl的表達(dá)可阻止生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂。因此，Dazl－Tex14將生殖細(xì)胞巢內(nèi)細(xì)胞間橋斷裂與減數(shù)分裂兩個(gè)不同細(xì)胞活動(dòng)連接起來。生殖細(xì)胞巢內(nèi)細(xì)胞間橋斷裂是形成原始卵泡的先決條件。原始卵泡形成時(shí)發(fā)生三個(gè)不同的細(xì)胞生物學(xué)現(xiàn)象：（1）生殖巢內(nèi)細(xì)胞間橋斷裂。大約有2／3的卵原細(xì)胞通過凋亡／自嗜（apoptosis／autophage）死亡［15－16］，只有1／3的卵原細(xì)胞能夠與前體顆粒細(xì)胞形成原始卵泡［17］。（2）卵原細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂，并停滯在減數(shù)分裂的前期，形成初級(jí)卵母細(xì)胞［18］。（3）生殖細(xì)胞巢外周的前體顆粒細(xì)胞侵入生殖細(xì)胞巢［10］，包圍一些優(yōu)勢(shì)卵原細(xì)胞，形成原始卵泡，阻止了卵母細(xì)胞退化，使初級(jí)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂停滯在減數(shù)分裂前期。

顆粒細(xì)胞前體細(xì)胞是分化形成卵泡顆粒細(xì)胞的前體細(xì)胞，在形成生殖細(xì)胞巢時(shí)顆粒細(xì)胞前體細(xì)胞位于生殖細(xì)胞巢外周［9］，當(dāng)生殖細(xì)胞巢被激活、細(xì)胞間橋斷裂時(shí)，顆粒細(xì)胞前體細(xì)胞發(fā)生遷移，侵入生殖細(xì)胞巢。顆粒細(xì)胞前體細(xì)胞呈扁平狀，通常每個(gè)原始卵泡由10個(gè)左右扁平的前體細(xì)胞包圍。在小鼠出生前位于卵巢髓質(zhì)和皮質(zhì)的原始卵泡是由表達(dá)不同標(biāo)記蛋白的顆粒細(xì)胞前體細(xì)胞構(gòu)成［19］。髓質(zhì)的原始卵泡前體顆粒細(xì)胞來源于髓質(zhì)表達(dá)Foxl2基因［20］，而皮質(zhì)的原始卵泡是由表達(dá)Lgr5基因的顆粒細(xì)胞前體細(xì)胞構(gòu)成，在形成原始卵泡時(shí)它們由近表皮內(nèi)遷至深皮質(zhì)部［21］。兩類不同部位和細(xì)胞組成的原始卵泡在卵泡發(fā)生時(shí)間和速度上不同［19，22－23］，絕大多數(shù)位于髓質(zhì)部的原始卵泡從出生就開始生長(zhǎng)，而皮質(zhì)部卵泡發(fā)生開始于初情期前后，供應(yīng)動(dòng)物生殖周期所需要的全部卵泡［19，22］。

1.3 卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂

視黃酸（RA）是誘導(dǎo)生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂的關(guān)鍵化學(xué)物質(zhì)［24］。RA通過誘導(dǎo)生殖細(xì)胞表達(dá)Stra8誘導(dǎo)生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂［25－27］。敲除Stra8基因，卵巢上的生殖細(xì)胞既不進(jìn)行減數(shù)分裂，也不表達(dá)與減數(shù)分裂相關(guān)的基因［26，28］。在性別分化后PGC分化形成EGCs，開始表達(dá)Dazl［29］，Dazl蛋白是在生殖細(xì)胞特異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白［30］，敲除Dazl基因的小鼠EGCs細(xì)胞喪失產(chǎn)生配子的潛能。生殖細(xì)胞表達(dá)Dazl是RA誘導(dǎo)Stra8表達(dá)進(jìn)行減數(shù)分裂的先決條件［29，31－33］。由此可見，Dazl是生殖細(xì)胞獲得減數(shù)分裂潛能的關(guān)鍵分子。DMRT1（doublesex and mab－3 related transcription factor）是參與減數(shù)分裂調(diào)節(jié)的一個(gè)基因［34］。在雄性和雌性生殖細(xì)胞中DMRT1表現(xiàn)不同的生物功能［35－36］，在DMRT1敲除的雌性小鼠生殖細(xì)胞中，Stra8的表達(dá)水平下降，卵巢上的卵泡數(shù)減少［36］。RA通過與細(xì)胞核內(nèi)的RA受體（RAR）結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。在Stra8基因的啟動(dòng)子有兩個(gè)潛在的RAREs結(jié)合域，RA可能與RAR／RXR異二聚體形成復(fù)合體，并與RAREs結(jié)合，直接調(diào)節(jié)Stra8的表達(dá)［37－38］。

2 OSCs

2.1 OSCs的發(fā)現(xiàn)

無脊椎動(dòng)物（如果蠅）及低等脊椎動(dòng)物（如魚、鳥）的卵巢中有OSCs，這些OSCs可以通過有絲分裂進(jìn)行自我復(fù)制，同時(shí)周期性或不間斷地分化產(chǎn)生新的卵母細(xì)胞，維持體內(nèi)原始卵泡的數(shù)量。哺乳動(dòng)物出生后，卵巢中原始卵泡的數(shù)量一定，隨著生殖周期的進(jìn)行，卵巢中卵泡數(shù)量不斷減少，直至消耗完為止，而卵巢不再產(chǎn)生新的卵母細(xì)胞［39］。但是過去幾年，哺乳動(dòng)物卵原干細(xì)胞研究挑戰(zhàn)了這個(gè)傳統(tǒng)生殖生物學(xué)觀點(diǎn)。

2004年J.Johnson等［1］對(duì)小鼠卵巢中是否存在OSCs進(jìn)行研究并得出以下三點(diǎn)結(jié)論：（1）雌性小鼠在產(chǎn)后16～40 d內(nèi)原始卵泡共減少了294個(gè)。M.J.Faddy等［40］的研究表明，在產(chǎn)后14～42 d原始卵泡庫(kù)由于卵泡閉鎖及生長(zhǎng)激活，到初級(jí)卵泡階段每天平均應(yīng)減少89個(gè)原始卵泡。據(jù)此推算在J.Johnson等［1］的研究中，產(chǎn)后16～40 d期間原始卵泡共應(yīng)減少2 136個(gè)。但這與J.Johnson等［1］的試驗(yàn)結(jié)果差異較大。因此，推測(cè)在小鼠卵巢中存在某種干細(xì)胞，它會(huì)分化形成卵母細(xì)胞用以補(bǔ)充原始卵泡庫(kù)。（2）在青年及成年雌性小鼠卵巢中具有同時(shí)表達(dá)Brdu及Ddx4的細(xì)胞，證明卵巢中存在具有有絲分裂活性的生殖細(xì)胞。（3）將帶有GFP標(biāo)記的小鼠卵巢組織切半后移植到切掉一半卵巢組織的GFP陰性SCID小鼠卵巢包膜內(nèi)，4周后發(fā)現(xiàn)，部分GFP陽性卵巢組織及部分GFP陰性卵巢組織中均可發(fā)現(xiàn)由GFP標(biāo)記的卵母細(xì)胞、不帶GFP標(biāo)記的顆粒細(xì)胞包裹形成的重組卵泡，以及由不帶GFP標(biāo)記的卵母細(xì)胞與帶有GFP標(biāo)記的顆粒細(xì)胞組合形成的重組卵泡。該結(jié)果進(jìn)一步說明小鼠卵巢中具有可遷移的生殖細(xì)胞且可支持卵泡發(fā)生。根據(jù)以上三點(diǎn)，推測(cè)小鼠卵巢中存在既可以進(jìn)行有絲分裂又可以分化形成卵子的細(xì)胞，該研究引發(fā)了生殖生物學(xué)領(lǐng)域?qū)τ诖菩圆溉閯?dòng)物卵巢中是否具有OSCs的研究熱潮。

2005年，J.Johnson等［41］研究發(fā)現(xiàn)了在小鼠骨髓外周血細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，將帶有GFP標(biāo)記的骨髓外周血細(xì)胞通過尾靜脈注射到SCID小鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)在受體小鼠的卵巢中存在帶有GFP標(biāo)記的卵母細(xì)胞生成。推測(cè)在骨髓外周血中存在具有分化形成卵母細(xì)胞能力的干細(xì)胞。但這個(gè)結(jié)論在2006年遭到一些學(xué)者的質(zhì)疑，通過外科手術(shù)將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的脈管系統(tǒng)相連，制備并聯(lián)體小鼠，小鼠并聯(lián)一段時(shí)間后觀察卵子發(fā)生，結(jié)果表明，帶有GFP標(biāo)記的骨髓細(xì)胞或其他血液循環(huán)細(xì)胞可以進(jìn)入野生型小鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)；但是野生型小鼠的卵巢中卻沒有GFP標(biāo)記的卵母細(xì)胞。這說明骨髓外周血中的細(xì)胞并不能夠分化形成卵母細(xì)胞［42］。但骨髓造血干細(xì)胞確實(shí)有助于卵巢功能的恢復(fù)。研究表明，患有范科尼貧血癥的婦女在進(jìn)行了骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）后成功懷孕［43－44］。但研究者并未檢測(cè)到由供體骨髓細(xì)胞形成的生殖細(xì)胞。因此推測(cè)，BMT可以促進(jìn)由不完全卵泡耗竭引起的卵巢功能衰竭后卵巢功能的恢復(fù)，但骨髓外周血中的細(xì)胞并不能轉(zhuǎn)化為卵母細(xì)胞。

2009年，Zou K.等［2］利用羧基端Ddx4蛋白抗體進(jìn)行磁珠分選（magnetic cell sorting，MACS），首次從出生5 d后的小鼠卵巢中分離獲得OSCs，在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后OSCs始終表達(dá)生殖干細(xì)胞標(biāo)志基因Oct4、Ddx4、Ifitm3（Fragillis）、Dppa3、Rex1、Dazl和Blimp－1等；將長(zhǎng)期培養(yǎng)后的OSCs注射到小鼠卵巢，可以得到由該細(xì)胞系產(chǎn)生的健康子代小鼠。

研究表明，使用熒光激活分選（Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）方法從處于育齡階段的女性卵巢中分離得到了Ddx4陽性的細(xì)胞，該細(xì)胞經(jīng)過長(zhǎng)期培養(yǎng)可在體外建系，將該細(xì)胞與人卵巢上皮共同注射移植到SCID小鼠卵巢中，可在受體小鼠卵巢中檢測(cè)到由該細(xì)胞分化形成的卵母細(xì)胞［45］。

2.2 OSCs的研究爭(zhēng)議

關(guān)于OSCs的研究仍在許多爭(zhēng)議，這些爭(zhēng)議主要集中在以下幾個(gè)方面。

2.2.1 使用Ddx4蛋白抗體分選OSCs的有效性

目前在大多數(shù)研究中使用的用于分離、純化OSCs的特異蛋白Ddx4是已知的在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的蛋白。Ddx4是生殖細(xì)胞特異性表達(dá)的RNA解旋酶，含有一個(gè)DEADc ATP水解結(jié)構(gòu)域和一個(gè)HELICc RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這是所有DEAD盒蛋白家族成員的共同特征［46］。而RNA結(jié)合蛋白是胞質(zhì)蛋白，不是膜結(jié)合蛋白。2012年，Zhang H.等［47］研究了卵巢Ddx4陽性細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖分化情況，活體成像監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在72 h內(nèi)小鼠睪丸中Ddx4陽性細(xì)胞平均分裂3次，而在卵巢中并沒有監(jiān)測(cè)到Ddx4陽性細(xì)胞的分裂。同時(shí)利用Zou K.等［2］報(bào)道的體外培養(yǎng)條件培養(yǎng)Ddx4陽性細(xì)胞，培養(yǎng)數(shù)天后陽性細(xì)胞死亡；在培養(yǎng)Ddx4陰性的卵巢細(xì)胞時(shí)，可形成類似于人OSCs體外培養(yǎng)形成的扁平狀細(xì)胞克隆，該克隆可傳代到10代以上，但是這些細(xì)胞并不表達(dá)Sox2、Oct4、Dppa3及Ddx4等基因；將其移植回受體小鼠的卵巢內(nèi)，也不能分化成卵母細(xì)胞。因此Ddx4作為分選OSCs抗體的有效性有待進(jìn)一步探索。

雖然Zou K.等［48］進(jìn)一步篩選了三個(gè)用于分離OSCs的特異蛋白，包括黏附分子STPB－C（shorttype pituitary gland and brain－cadherin，STPBC）、用于純化SSCs的膜蛋白CD90以及干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（interferon inducible transmembrane proteins 3，Ifitm3，也稱為Fragilis），發(fā)現(xiàn)使用Ifitm3抗體來分選純化OSCs的效率比使用Ddx4抗體更高。但是Ifitm3在小鼠中多個(gè)組織、器官中均有表達(dá)，在肝臟中表達(dá)量最高，在睪丸中表達(dá)量較低，并不是生殖細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，而且Ifitm3在卵巢體細(xì)胞中也有表達(dá)，因此并不能特異性篩選OSCs。

2.2.2 卵巢中并沒有干細(xì)胞可以補(bǔ)充原始卵泡庫(kù)

2014年，Zhang H.等［49］利用Gdf9－Cre×iDTR、Sohlh1－CreERT2×R26R轉(zhuǎn)基因小鼠模型追蹤卵子再生的過程，結(jié)果表明卵巢中并沒有OSCs可補(bǔ)充卵泡庫(kù)。Gdf9是卵母細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，在卵母細(xì)胞發(fā)育的所有階段均有表達(dá)。研究表明Gdf9在小鼠OSCs中并不表達(dá)，因此其表達(dá)與否可以區(qū)分OSCs與卵母細(xì)胞。當(dāng)用白喉毒素（diphtheria toxin，DT）處理后，Gdf9－Cre介導(dǎo)卵母細(xì)胞中DT受體（diphtheria toxin receptor，DTR）的表達(dá)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡。在DT處理2周后，可以觀察到Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢中的卵母細(xì)胞完全消失。DT處理2個(gè)月后，與對(duì)照組iDTR小鼠的卵巢相比，Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢明顯變小，并且沒有任何卵母細(xì)胞或卵泡再生現(xiàn)象。將觀察時(shí)間延長(zhǎng)至DT處理后6個(gè)月和12個(gè)月后，均沒有發(fā)現(xiàn)Gdf9－Cre×iDTR小鼠卵巢中有卵母細(xì)胞或卵泡再生。因此得出結(jié)論：給予DT處理之前小鼠卵巢中存在的初始卵泡庫(kù)是小鼠卵巢中生殖細(xì)胞的唯一來源。

Sohlh1僅在減數(shù)分裂阻滯的未成熟卵母細(xì)胞中激活表達(dá)。將Sohlh1－CreERT2小鼠與Rosa26報(bào)告基因小鼠（R26R）雜交，產(chǎn)生子代小鼠Sohlh1－CreERT2×R26R，通過向Sohlh1－Cre-ERT2×R26R小鼠注射他莫昔芬（Tamoxifen）可選擇性地標(biāo)記表達(dá)Sohlh1的未成熟卵母細(xì)胞。在小鼠產(chǎn)后28天注射Tamoxifen，在第35天觀察到小鼠卵巢中表達(dá)Sohlh1的未成熟卵母細(xì)胞可被β－半乳糖苷酶染成藍(lán)色。作為對(duì)照，在妊娠8.5～12.5 dpc這一PGCs形成階段給孕鼠注射Tamoxifen，在產(chǎn)后2個(gè)月子代小鼠卵巢中并沒有β－半乳糖苷酶染成藍(lán)色的卵母細(xì)胞。這證明Sohlh1－CreERT2×R26R小鼠模型僅特異性地標(biāo)記已進(jìn)入減數(shù)分裂的未成熟卵母細(xì)胞，卻并不能標(biāo)記更早期的PGCs或與之處于相似分化程度的OSCs。因此，如果卵巢中存在OSCs可以補(bǔ)充原始卵泡庫(kù)，那卵巢中標(biāo)記的卵母細(xì)胞與未被標(biāo)記的卵母細(xì)胞比例應(yīng)降低。但在該試驗(yàn)中給產(chǎn)后28天小鼠注射Tamoxifen，在2個(gè)月及8個(gè)月分別取出小鼠左側(cè)卵巢及右側(cè)卵巢，結(jié)果表明：在2個(gè)月時(shí)一些標(biāo)記的卵母細(xì)胞被激活并發(fā)育為次級(jí)卵母細(xì)胞，標(biāo)記的卵母細(xì)胞占總數(shù)的百分比為（37.41±5.37）%；在8個(gè)月時(shí)收集右側(cè)卵巢，標(biāo)記的卵母細(xì)胞占總數(shù)的百分比為（37.74±6.55）%，并沒有顯著減少。這說明小鼠2～8月齡期間并無任何新生的卵母細(xì)胞補(bǔ)充卵泡庫(kù)，小鼠卵巢在出生后即有一個(gè)穩(wěn)定的卵泡庫(kù)，支持一生的卵母細(xì)胞發(fā)育。

2.2.3 OSCs的來源仍未確定 關(guān)于OSCs來源于何種細(xì)胞，目前主要有以下三種觀點(diǎn)：（1）OSCs來源于骨髓外周血循環(huán)中的某些干細(xì)胞。如前所述，大量關(guān)于BMT移植回受體小鼠卵巢的試驗(yàn)證明，骨髓外周血的細(xì)胞并不能分化形成卵母細(xì)胞，因此這一觀點(diǎn)已被否定［42］。（2）OSCs來源于卵巢表面上皮（ovary suerface epithelium，OSE）中的極小胚胎樣干細(xì)胞（very small embryonic－like，VSEL）。覆蓋在卵巢表面的OSE細(xì)胞由單層立方或扁平上皮細(xì)胞組成。研究發(fā)現(xiàn)，在OSE中存在OSCs及VSEL兩類干細(xì)胞，這兩類細(xì)胞主要差異在于細(xì)胞直徑及Oct4的表達(dá)，VSEL相對(duì)靜止，大小為3～5μm，Oct4核表達(dá)；而OSCs的大小超過8μm，Oct4質(zhì)表達(dá)，具有有絲分裂活性。核表達(dá)Oct4對(duì)于干細(xì)胞處于多能狀態(tài)至關(guān)重要。因此推測(cè)VSEL是卵巢中最原始的干細(xì)胞，在卵巢受到某種刺激后VSEL可分化形成OSCs［50－51］。（3）OSCs來源于少量具有干細(xì)胞特征的PGCs衍生未分化細(xì)胞，這些細(xì)胞可以保留在出生后的卵巢中，在某些情況下可能恢復(fù)減數(shù)分裂和分化產(chǎn)生卵子［52］。哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生及卵子發(fā)生都起源于PGCs，并且部分PGCs經(jīng)特殊的培養(yǎng)條件培養(yǎng)后具有類似多能干細(xì)胞的特性。產(chǎn)前小鼠卵巢中存在未進(jìn)入減數(shù)分裂的PGCs，細(xì)胞數(shù)目較多，占生殖細(xì)胞總數(shù)的10%；在產(chǎn)后PGCs可進(jìn)行有絲分裂，激活卵巢，因此推測(cè)OSCs來源于少量未分化的PGCs［52］。并且在整個(gè)胚胎發(fā)育階段，PGCs分化形成卵母細(xì)胞的過程經(jīng)歷了復(fù)雜的全基因組重編程，該過程需要與卵巢的體細(xì)胞相互作用。因此，如果OSCs來源于卵巢中其他的體細(xì)胞，則需要在成年卵巢環(huán)境中經(jīng)歷在胚胎發(fā)育過程中建立的生殖系細(xì)胞所需的基因及表觀遺傳的改變，并產(chǎn)生具有正確染色質(zhì)表觀遺傳狀態(tài)的卵母細(xì)胞，特別是與全能性和印記基因相關(guān)的表觀遺傳狀態(tài)，然而這一過程是非常難實(shí)現(xiàn)的，因此推測(cè)OSCs不可能來源于生殖系以外的其他細(xì)胞。

2.3 OSCs的特征

OSCs存在于卵巢表面上皮中，其細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)模式與SSCs較為相似，細(xì)胞直徑為8～10μm，核質(zhì)比較高。OSCs在體外培養(yǎng)形成串狀克隆，類似于PGCs在體外培養(yǎng)時(shí)形成的克隆，串狀的OSCs分裂后其細(xì)胞膜相連，在連接處表達(dá)E－cadherin蛋白（也稱為Cdh1），該蛋白參與形成串狀OSCs克隆的黏著連接［53］。關(guān)于果蠅OSCs的研究表明，雌性生殖細(xì)胞所必需的E－cadherin蛋白是維持細(xì)胞間相互作用和形成細(xì)胞微環(huán)境所必需的蛋白。在小鼠PGCs體外培養(yǎng)過程中，抑制E－cadherin蛋白的表達(dá)會(huì)影響PGCs之間聚集，在培養(yǎng)iPSCs時(shí)抑制E－cadherin蛋白的表達(dá)會(huì)使形成的細(xì)胞克隆解離。OSCs倍增時(shí)間約為22 h，增殖較慢；OSCs表達(dá)Ddx4、Oct4、Dazl、Blimp－1、Dppa3等生殖細(xì)胞及干細(xì)胞標(biāo)志蛋白，但不表達(dá)Sox2、Nanog這兩個(gè)多能性相關(guān)蛋白及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂相關(guān)蛋白（如Gdf9、Sycp3、Zp3等）［54］。OSCs具有很高的端粒酶活性及堿性磷酸酶陽性，其堿性磷酸酶表達(dá)水平與SSCs相似，但比ESCs表達(dá)水平低。OSCs注射到SCID小鼠皮下后并不能形成畸胎瘤，也沒有三胚層的分化。將OSCs注射到卵巢，可分化形成功能性卵子并產(chǎn)生健康子代，代表OSCs是一種單能干細(xì)胞，僅可分化形成卵子［45，54］。在小鼠及人的OSCs體外培養(yǎng)過程中，可自發(fā)分化形成卵母細(xì)胞樣細(xì)胞。體外培養(yǎng)過程中根據(jù)DNA倍性分析可以檢測(cè)到有單倍體細(xì)胞的產(chǎn)生［45］，這種自發(fā)分化產(chǎn)生的在形態(tài)上類似于卵母細(xì)胞的樣細(xì)胞表達(dá)減數(shù)分裂相關(guān)基因（包括Sycp3、Dmc1、Nobox、Ybx2等）及卵母細(xì)胞透明帶標(biāo)志蛋白Zp3。

此外，通過基因芯片分析OSCs與SSCs的全基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSCs與SSCs在基因表達(dá)水平上具有很高的相似性。去除管家基因后，在OSCs高表達(dá)的1 273個(gè)基因以及在SSCs高表達(dá)的1 193個(gè)基因中，共有853個(gè)基因是兩種生殖干細(xì)胞共同高表達(dá)的。這些共同高表達(dá)基因主要包括生殖干細(xì)胞標(biāo)志基因（如Ddx4、Dazl和Oct4）及PGCs發(fā)育相關(guān)基因（如Tdrkh、Akt3、Gm1673、Hba－a1、Mov10l1、Fkbp6等）［55］。對(duì)ESCs、PGCs以及OSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA－Seq）分析，結(jié)果表明，Nanog和Sox2在ESCs中特異性表達(dá)，而Ifitm3、Ptx3、GM1673在OSCs中表達(dá)［56－57］。

為了了解OSCs如何維持其單能性，對(duì)OSCs進(jìn)行RNA－Seq分析，發(fā)現(xiàn)Prmt5在OSCs中高表達(dá)［56］。細(xì)胞免疫熒光染色試驗(yàn)結(jié)果表明，Prmt5主要在OSCs的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，將OSCs中的Prmt5基因敲減后，發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂相關(guān)基因（包括Sycp3和Sycp1）及卵子發(fā)育相關(guān)基因（包括Zp2和Zp3）上調(diào)。為了進(jìn)一步了解Prmt5對(duì)OSCs基因表達(dá)的影響，對(duì)使用Prmt5敲減后的OSCs進(jìn)行了RNA－Seq分析，與對(duì)照組相比，Prmt5敲減后OSCs中2 916個(gè)基因被上調(diào)，GO富集分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要富集在與減數(shù)分裂相關(guān)的過程及一些與發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)過程。這些研究表明，Prmt5參與了OSCs未分化狀態(tài)的維持，其作用機(jī)制可能是通過抑制減數(shù)分裂和體細(xì)胞過程來維持OSCs干性［56］。在OSCs、ESCs兩類干細(xì)胞具有相同的抑制分化機(jī)制。Prmt5與Mep50結(jié)合促進(jìn)胞質(zhì)組蛋白H2A（H2AR3me2s）甲基化，從而抑制ESCs的分化［58］，同樣Prmt5與Mep50結(jié)合形成復(fù)合物在OSCs中也發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄作用。除Prmt5外，還發(fā)現(xiàn)Max可抑制ESCs中減數(shù)分裂相關(guān)基因及其表達(dá)水平，同樣當(dāng)Max在OSCs中被敲減后一些減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達(dá)被顯著上調(diào)［59］。這些結(jié)果表明OSCs和ESCs具有某些相同的抑制分化機(jī)制。

2.4 OSCs的增殖調(diào)控

OSCs是存在于OSE中的一類稀有的干細(xì)胞，具有挽救因卵泡衰竭引起的女性不育的潛力。最近關(guān)于調(diào)控OSCs增殖的研究日益增多。

鈣黏著蛋白在生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中均有表達(dá)，并參與細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能［60］。作為鈣黏著蛋白超家族的成員之一，Cadherin－22最早發(fā)現(xiàn)于大鼠的垂體和大腦，具有兩種剪接異構(gòu)體長(zhǎng)型和短型。長(zhǎng)型Cadherin－22的胞質(zhì)部分包含β－連環(huán)蛋白（β－catenin）結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而短型則缺乏該結(jié)構(gòu)域［61］。小鼠卵巢中各階段的生殖細(xì)胞包括OSCs均表達(dá)Cadherin－22［62］。已有的研究證明，短型Cadherin－22可通過JAK－STAT、PI3KAKT和TGF－β信號(hào)通路來促進(jìn)大鼠SSCs存活及增殖［62－63］。Cadherin－22與PI3K相互作用后對(duì)AKT3進(jìn)行磷酸化，可以增強(qiáng)細(xì)胞周期蛋白家族成員N－myc在OSCs中的表達(dá)水平，促進(jìn)OSCs自我更新。

此外，作為TGF－β家族的成員，GDNF被認(rèn)為是促進(jìn)SSCs自我更新的關(guān)鍵因子。研究表明，GDNF對(duì)于OSCs自我更新也具有重要作用，GDNF與OSCs表面受體GFRα1結(jié)合，通過PI3K或酪氨酸家族激酶（SFK）激活A(yù)KT3，并且SFK也可上調(diào)其目標(biāo)基因Bcl6b、Etv5、Lhx1，促進(jìn)OSCs的自我更新［64］。研究表明，AKT3對(duì)于SSCs的增殖也至關(guān)重要［65］。AKT是一個(gè)多功能因子，參與了多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞不同的生物學(xué)功能，例如細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活等，對(duì)于SSCs的增殖調(diào)節(jié)也具有關(guān)鍵作用。PIK－AKT－mTOR信號(hào)通路在維持SSCs自我更新上起到關(guān)鍵作用，PI3K由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基p85和一個(gè)催化亞基p110組成，PI3K激活后，質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白AKT和PDK1結(jié)合，促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308，使AKT活化［66］。AKT磷酸化TSC1／2，可阻止其對(duì)小G蛋白R(shí)heb（ras homology enriched in brain）的負(fù)調(diào)控，一方面使Rheb富集，另一方面活化對(duì)納巴霉素（rapamycin）敏感的mTOR復(fù)合體（mammalian target of rapamycin，mTORC1）［67］。AKT也可以對(duì)GSK3β進(jìn)行磷酸化，磷酸化后GSK3β失去活性，可以促進(jìn)葡萄糖的代謝以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。

2012年Hu Y.等［68］從新生和成年小鼠卵巢中分離了OSCs，并將其培養(yǎng)在ESCs的培養(yǎng)液中，結(jié)果表明，添加LIF和GSK3抑制劑BIO有利于OSCs形成類似于ESCs的Dome狀克隆，BIO通過激活β－catenin和上調(diào)E－cadherin促進(jìn)OSCs的增殖，并促進(jìn)OSCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志基因（如Oct4、Klf4、C－myc、Nanog、CD49f、Sox2、CD133、SSEA1和SSEA4）。

2.5 OSCs體外分化形成卵母細(xì)胞的研究

研究OSCs體外分化形成卵母細(xì)胞，對(duì)于生殖醫(yī)學(xué)治療因女性卵巢卵泡衰竭引起的不孕癥具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)外的研究團(tuán)隊(duì)近年來致力于將小鼠或人的OSCs在體外分化形成功能性卵母細(xì)胞，進(jìn)行了OSCs體外分化形成卵母細(xì)胞體系的比較。2018年，Zou K.等［69］比較了五種將OSCs分化形成卵母細(xì)胞的體系，將OSCs分化形成卵母細(xì)胞的第一步是誘導(dǎo)其進(jìn)入減數(shù)分裂，在12.5 dpc的胚胎中。RA可誘導(dǎo)PGCs進(jìn)入減數(shù)分裂。Zou K.等［69］將OSCs培養(yǎng)于添加RA的培養(yǎng)液（去除LIF）中，數(shù)天后觀察到一些圓形細(xì)胞直徑增長(zhǎng)至25～40μm。隨后將其培養(yǎng)在鋪有一層顆粒細(xì)胞的微滴中，添加雌二醇、孕酮繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素的添加有助于OSCs分化，最終形成形態(tài)上類似于GV期卵母細(xì)胞的樣細(xì)胞，但繼續(xù)培養(yǎng)后這些類卵母細(xì)胞樣細(xì)胞并不能發(fā)育至MⅡ期。

2.6 OSCs的研究意義

近年來，有大量證據(jù)支持在包括小鼠、人類等各種哺乳動(dòng)物的產(chǎn)后卵巢中存在具有有絲分裂活性的生殖細(xì)胞，這使得利用一種天然的具有生殖細(xì)胞命運(yùn)的成體干細(xì)胞在體外分化形成功能性配子成為可能。目前的研究經(jīng)過各種鑒定方式證實(shí)了OSCs在卵巢中的功能，包括體內(nèi)移植試驗(yàn)成功獲得配子以及人類OSCs分化形成卵母細(xì)胞樣細(xì)胞的最新研究。這些研究使人們對(duì)雌性生殖生物學(xué)進(jìn)行重新認(rèn)識(shí)，并進(jìn)一步探索OSCs對(duì)女性生育力保護(hù)的潛在應(yīng)用價(jià)值。