王倩，劉憶霜

·綜述·

NDM-1抑制劑研究進展

王倩，劉憶霜

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室

抗生素的發(fā)現(xiàn)是人類抵御細菌感染性疾病的重大突破。然而隨著抗生素的廣泛使用和濫用，細菌多藥耐藥問題日益嚴峻，對人類健康構(gòu)成了巨大的威脅。碳青霉烯類抗生素一度被視為革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”，但隨著碳青霉烯酶的出現(xiàn)，碳青霉烯耐藥的革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌）在全球范圍內(nèi)快速蔓延，為臨床治療帶來了新的挑戰(zhàn)[1-3]。

新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1（New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1），屬于 B1 類金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamases，MBLs），自 2008 年首次被報道以來，NDM-1 因其廣譜耐藥作用（可水解除單環(huán) β-內(nèi)酰胺類以外所有的 β-內(nèi)酰胺類抗生素）、變異體的多樣性（通過不同位置的氨基酸發(fā)生突變進化出的新變種已達 24 個）、可轉(zhuǎn)移性（編碼基因NDM-1 可通過質(zhì)粒迅速傳播）而備受關(guān)注[2, 4-6]。表達 NDM-1 的菌株可引起尿道感染、肺部感染、敗血癥等多種疾病，但臨床治療結(jié)果顯示，以表達 NDM-1 為特點的“超級細菌”僅對黏菌素、替加環(huán)素、磷霉素等少量抗生素敏感[2, 4, 7]。因此，尋找低毒高效的 NDM-1 抑制劑是研究者們亟待解決的重大科學問題。

1 NDM-1 的結(jié)構(gòu)及催化機制

NDM-1 具有典型的 αβ/βα 夾層結(jié)構(gòu)，其活性中心包含兩個由氫氧根橋接的二價鋅離子：Zn1（與氨基酸His120、His122、His189配位）和 Zn2（與氨基酸Asp124、Cys208、His250配位）[4]。NDM-1 的催化機制尚無明確定論，部分學者認為其遵循雙鋅催化機制，主要假說為：底物通過羰基氧原子與 Zn1 配位、內(nèi)酰胺氮原子與 Zn2 配位來極化內(nèi)酰胺鍵，親核的羥基攻擊底物羰基碳，形成過渡態(tài)復合體，最終導致 C-N 鍵的斷裂，內(nèi)酰胺氮原子以陰離子的形式被釋放，Zn2 作為超強酸提供質(zhì)子使其穩(wěn)定[8]。

2 NDM-1 抑制劑的研究現(xiàn)狀

目前文獻報道的 NDM-1 抑制劑高達 500 多個[4]，根據(jù)作用機制可大概分為三類：第一類抑制劑直接作用于 NDM-1 活性部位的鋅離子，如金屬離子螯合劑三（2-吡啶基甲基）胺[tris(2-pyridylmethyl)amine，TPA]衍生物、真菌代謝產(chǎn)物曲霉明A（aspergillomarasmine A，AMA）等，通過螯合或替換鋅離子抑制 NDM-1 的水解活性；第二類抑制劑則通過作用于 NDM-1 的氨基酸殘基，阻礙 NDM-1 與底物結(jié)合，如紫檀芪、厚樸酚等；第三類抑制劑可同時靶向 NDM-1 活性部位的鋅離子及催化關(guān)鍵氨基酸，發(fā)揮對NDM-1 的抑制作用，該類抑制劑包括天然植物成分蒽貝素、黃芩苷等。除上述三類抑制劑外，還有部分活性物質(zhì)可通過其他機制抑制 NDM-1，如肽偶聯(lián)磷酸二酰胺嗎啉低聚物（PPMO）；或作用機制尚不明確，如 ANT431。

2.1 與鋅離子相互作用的抑制劑

2.1.1 依地酸鈣鈉 依地酸鈣鈉是一種ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA與鈣離子的絡(luò)合物，在臨床上被批準用于鉛中毒的解毒治療。與 EDTA相比，依地酸鈣鈉的毒性較低[9]。Aoki 等發(fā)現(xiàn)依地酸鈣鈉可降低亞胺培南對產(chǎn) MBLs（IMP-1/2/7/10 和 VIM-2）的臨床分離菌株的minimum inhibitory concentration，MIC。在后續(xù)研究中，該團隊又證實了依地酸鈣鈉可以降低亞胺培南和美羅培南對 NDM-1 陽性菌株的 MIC（亞胺培南 MIC ≤ 1 ~ 2 μg/ml；美羅培南MIC ≤1 ~ 4 μg/ml），在 NDM-1 陽性菌株感染的小鼠膿毒癥模型中，依地酸鈣鈉與亞胺培南/西司他丁鈉聯(lián)合使用可降低細菌數(shù)量[10]。

2.1.2 TPA 衍生物 以傳統(tǒng)的金屬螯合劑為骨架設(shè)計合成結(jié)構(gòu)修飾物以規(guī)避其體內(nèi)毒性，保留其良好的活性是研究者尋找 NDM-1 抑制劑的重要策略之一。Schnaars等[11]以選擇性鋅螯合劑TPA為骨架合成了一系列衍生物，其中 6 個衍生物對美羅培南具有較好的增效作用，且對 HepG2 細胞具有相對較低的毒性（IC50> 100 μmol/L）。代表性化合物 15（圖 1）可使美羅培南對所檢測的產(chǎn)MBL（VIM-1、NDM-1、VIM-29）臨床分離株的 MIC降低至原來的1/32 ~ 1/256，但對產(chǎn)絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶（serine β-lactamases，SBLs）的臨床分離株無明顯作用。生化分析結(jié)果顯示，化合物 15 對純化的 NDM-1 和 VIM-2 均有抑制活性，inact/I分別為 12.5 L/(mmol·min) 和 0.500 L/(mmol·min)。

2.1.3 DPA 衍生物 Chen 等[12]以吡啶-2,6-二甲酸（2,6-dipicolinic acid，DPA）為骨架合成的衍生物 36（圖 1）對 NDM-1 有良好的抑制活性（IC50值降低至 DPA 的1/5：80 ± 2 nmol/L），同時對 VIM-2 和 IMP-1 的抑制作用也較 DPA 增強。100 mg/L 化合物 36 與亞胺培南聯(lián)合使用可使亞胺培南對產(chǎn) NDM-1 臨床分離菌株的 MIC 降低至敏感水平，且在此濃度下，化合物 36 對細菌細胞和人源細胞HEK293 均無明顯損傷作用?；衔?36 對體內(nèi)其他鋅離子依賴的金屬酶如 HDACs、hCAII 亦無明顯抑制作用，說明化合物 36 具備良好的體內(nèi)安全性。核磁共振氫譜、電子順磁共振光譜和平衡透析實驗等結(jié)果表明，化合物 36 可能通過與 NDM-1 活性部位結(jié)合形成 NDM-1:Zn(II):抑制劑三元復合體而發(fā)揮抑制作用[12]。

圖 1 與鋅離子相互作用的抑制劑

2.1.4 (S,S)-乙二胺-N,N'-二琥珀酸 (S,S)-乙二胺-N,N'-二琥珀酸[(S,S)-ethylenediamine-N,N'-disuccinic acid，EDDS，圖 1]是由細菌產(chǎn)生的可生物降解的天然金屬螯合劑，對多種 MBLs 具有抑制活性，其中對 NDM-1 的作用最佳，IC50值為 0.18 μmol/L，加入外源性鋅離子可逆轉(zhuǎn)該抑制作用[13]。EDDS 與 β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用可顯著增強β-內(nèi)酰胺類抗生素對表達 NDM-1 的大腸桿菌突變株的活性，當 EDDS 濃度為 32 mg/L 時，可分別使美羅培南和亞胺培南對 NDM-1 表達突變株的 MIC 降低至原來的1/8533以下和 1/512。繼而檢測 EDDS 對多種表達不同碳青霉烯酶的臨床分離菌株的活性，結(jié)果表明，EDDS 可恢復亞胺培南對所有檢測的 MBLs 陽性株的抗菌活性，而對于 MBLs 陰性株，EDDS 的加入并不能改變其耐藥性[13]。在產(chǎn)NDM-1 肺炎克雷伯菌感染的體內(nèi)模型中，EDDS 與亞胺培南聯(lián)合用藥可使實驗組動物存活率顯著升高[13]。

2.1.5 繞丹寧類化合物 繞丹寧骨架（2-硫代-4-噻唑烷酮）是多種藥用天然產(chǎn)物的重要組成部分。在抗菌藥物研發(fā)中，繞丹寧亦是優(yōu)越的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，其衍生物具有很強的抗菌活性[14]。其中，代表性化合物 ML302 被報道為 VIM-2 和 IMP-1 的雙重抑制劑，并可增強亞胺培南對產(chǎn) VIM-2/IMP-1/NDM-1 臨床分離菌株的活性[15]。Brem等[16]通過 ML302 與 VIM-2 共結(jié)晶分析發(fā)現(xiàn)，ML302 可能通過水解產(chǎn)生硫烯酸鹽產(chǎn)物 ML302F（圖 1），ML302F 螯合 VIM-2 活性部位的兩個鋅離子從而抑制 VIM-2 的活性。進一步的生物活性檢測結(jié)果顯示，ML302F 對 MBLs（NDM-1、VIM-2 和 BcII 等）具有廣譜抑制活性，IC50<（1.76 ± 0.51）μmol/L[16]。

然而在 Xiang 等[17]的研究中，由繞丹寧類衍生物水解得到的硫烯酸鹽類化合物 3a（圖1）僅能抑制 VIM-2 和 L1 的活性，對 NDM-1 和 ImiS 并無抑制作用。同時發(fā)現(xiàn)二芳基取代的繞丹寧衍生物 2h-m（圖 1）對 MBLs（NDM-1、VIM-2、ImiS 和 L1）具有廣譜抑制活性，IC50< 16 μmol/L，與頭孢唑啉或亞胺培南聯(lián)合使用可增強產(chǎn) MBLs 重組工程菌對 β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。分子對接結(jié)果表明，化合物 2l 通過硝基（NDM-1、CphA 和 L1）或羧基（VIM-2）與酶活性部位的鋅離子配位結(jié)合，通過N-苯基與酶形成疏水相互作用。

2.1.6 二硫代氨基甲酸鹽衍生物 Ge 等[18]以二硫代氨基甲酸鹽為骨架設(shè)計合成的衍生物 DC1、DC8、DC10（圖 1）對進行檢測的 5 種 MBLs（NDM-1、VIM-2、IMP-1、ImiS 和 L1）具備廣譜抑制活性，其中針對 NDM-1 的 IC50值分別為 0.38、0.53 和 1.52 μmol/L。DC1 與頭孢唑啉聯(lián)合使用可提高重組 NDM-1 表達工程菌株對頭孢唑啉的敏感性，當 DC1 的濃度為 64 μg/ml 時，可使頭孢唑啉的 MIC 降低至原來的 1/16[18]。分子對接結(jié)果顯示，DC1 通過羥基和羰基與 NDM-1 活性部位的 Zn2+形成配位鍵而發(fā)揮可逆性抑制作用。

Wang 等[19]合成的二硫代氨基甲酸鹽衍生物 4a/4b（圖 1）和 Zhang 等[20]合成的 1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸（1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA）二硫代氨基甲酸鹽衍生物 5（圖 1）也可顯著提高產(chǎn) NDM-1 臨床分離菌株對美羅培南的敏感性。鋅離子回補實驗表明，上述化合物對 NDM-1 的抑制作用與對鋅離子的影響有關(guān)。

2.1.7 AMA AMA（圖 1）作為一種真菌來源的天然產(chǎn)物，可以快速不可逆地抑制 NDM-1 的催化活性，IC50值為（4.0 ±1.0）μmol/L，同時對 VIM-2 也有抑制作用，IC50值為（9.6 ± 2.4）μmol/L[21]。AMA 可以恢復 NDM/VIM 陽性臨床分離菌株（腸桿菌、不動桿菌和假單胞菌）對美羅培南的敏感性[21]。在產(chǎn) NDM-1 的肺炎克雷伯菌感染的小鼠模型中，AMA 與美羅培南聯(lián)合使用可使小鼠肝臟及脾臟的細菌負荷降低，存活率明顯升高[21]。鋅離子回補實驗和質(zhì)譜分析結(jié)果提示，AMA 可能通過去除 NDM-1 活性中心的 Zn2+發(fā)揮抑制活性[21]。

2.1.8 鉍制劑和銅制劑 抗幽門螺桿菌藥物膠體次枸櫞酸鉍（colloidal bismuth subcitrate，CBS）及相關(guān)鉍制劑能夠不可逆地抑制 B1 類 MBLs（NDM-1、VIM-2 和 IMP-4）的催化活性，X 射線晶體衍射分析表明其機制為 Bi3+替換活性中心的兩個 Zn2+，導致鋅離子輔因子的釋放[22]。在體外活性檢測中，CBS 及其他鉍制劑（Bi(NAC)3、Bi(NIT)3和Bi(PCM)2）與美羅培南聯(lián)合使用均可恢復美羅培南對 NDM-1 陽性臨床分離菌株的抗菌活性，其中以 Bi(NAC)3的作用最為顯著[22]。此外，CBS 與美羅培南聯(lián)合用藥可顯著提高 NDM-1 陽性大腸桿菌感染小鼠的存活率，這說明 CBS 在體內(nèi)也可發(fā)揮對 NDM-1 的抑制作用[22]。除 Bi3+以外，Cu2+也被報道具有 NDM-1 抑制活性，并可能影響 NDM-1的合成、成熟或穩(wěn)定，其與抗真菌劑吡啶硫酮的配位復合物有望成為臨床應用碳青霉烯類抗生素的佐劑[23]。

2.1.9 苯并異噻唑酮 苯并異噻唑酮是新近報道的可作為 NDM-1 共價不可逆抑制劑的骨架結(jié)構(gòu)，體內(nèi)及體外實驗表明，基于此結(jié)構(gòu)合成的化合物 1g（圖 1）對 NDM-1 有顯著的抑制活性（體外 IC50值為 0.16 μmol/L，體內(nèi) IC50值為 35.1 μmol/L）[24]?；衔?1g 與頭孢唑啉聯(lián)合給藥，可恢復頭孢唑啉對重組 NDM-1 表達工程菌的抗菌活性，當化合物 1g 的濃度為 16 μg/ml 時，可使頭孢唑啉的 MIC 降低至原來的 1/256。平衡透析實驗結(jié)果表明，化合物 1g 可能通過移除 NDM-1 活性部位的一個 Zn2+而抑制 NDM-1 的活性。

2.1.10 Thanatin Thanatin 是昆蟲經(jīng)誘導產(chǎn)生的一種抗菌肽，由 21 個氨基酸組成，在Cys11和 Cys18之間形成二硫鍵[25]。Ma 等[25]報道thanatin 通過競爭性替換 NDM-1 陽性菌外膜的二價陽離子，導致脂多糖釋放，從而破壞細菌外膜，發(fā)揮抗菌活性，當thanatin 劑量為 6 mg/kg時，可使產(chǎn)NDM-1 的大腸桿菌 XJ141026 感染的膿毒癥小鼠存活率達到 100%，并顯著降低血液、肝臟、脾臟及肺的細菌負荷。此外，thanatin 還可以通過替換 NDM-1 活性中心的鋅離子抑制 NDM-1 的催化活性[IC50值為（3.21? ± 0.78）?μmol/L，i 值為（2.84 ± 0.33）μmol/L]，逆轉(zhuǎn) NDM-1 陽性表達菌株對碳青霉烯類抗生素的抗性。在產(chǎn) NDM-1 的大腸桿菌 XJ141026 感染的小鼠膿毒癥模型中，0.1 mg/kg thanatin 與美羅培南聯(lián)合使用即可顯著提高實驗組小鼠的存活率，降低肝臟及脾臟的細菌負荷[25]。

2.2 與氨基酸殘基相互作用的抑制劑

2.2.1 紫檀芪 紫檀芪（圖 2）是一種最初從紫檀中分離出的酚類化合物，在傳統(tǒng)醫(yī)學中被用于糖尿病的治療[26]。在近期報道中，Liu 等[27]通過體外和體內(nèi)活性檢測揭示了紫檀芪作為 NDM-1 抑制劑的潛能。紫檀芪可以劑量依賴性地抑制 NDM-1 的活性（IC50值為 15.37 μg/ml），并可恢復美羅培南對 NDM-1 陽性表達菌株的抗菌效果。在小鼠大腿感染（NDM-1 陽性菌）實驗中，紫檀芪與美羅培南聯(lián)合給藥組小鼠大腿的細菌負荷顯著降低；在小鼠肺炎模型（NDM-1 陽性菌感染）實驗中，紫檀芪與美羅培南聯(lián)合給藥可使實驗小鼠的存活率顯著升高[27]。分子動態(tài)模擬結(jié)果提示，紫檀芪與 NDM-1 的氨基酸殘基 Trp93和 Asp124形成較強的相互作用，從而占據(jù) NDM-1 的催化口袋，阻礙 NDM-1 與底物結(jié)合，降低 NDM-1 的催化性能。

2.2.2 厚樸酚 厚樸酚（圖 2）是從木蘭樹皮中分離得到的天然產(chǎn)物，可通過與 NDM-1催化口袋的氨基酸殘基形成氫鍵或疏水相互作用阻礙酶與底物的結(jié)合，降低 NDM-1 的催化活性（IC50值為 6.47 μg/ml）[28]。厚樸酚可以恢復美羅培南對產(chǎn) NDM-1 的大腸桿菌 ZC-YN3 的抗菌活性，并在聯(lián)合用藥3 h 時達到完全殺菌的效果。分子對接結(jié)果顯示，厚樸酚可與 NDM-1 的氨基酸 Ser217形成氫鍵，并與 Val73、Lys211、Leu218、Gly219和 His250等氨基酸殘基相互作用[28]。

2.2.3 3-溴丙酮酸 小分子化合物 3-溴丙酮酸（圖 2）對 B1 類和 B2 類 MBLs 有潛在抑制活性，尤其以對NDM-1 的作用最為顯著（IC50值為 2.57 μmol/L），并且在三株不同 NDM-1 陽性表達的臨床分離菌株中，3-溴丙酮酸可不同程度地降低頭孢噻肟、美羅培南等 5 種 β-內(nèi)酰胺類藥物的 MIC[29]。鑒于 3-溴丙酮酸的類似物丙酮酸對 NDM-1 并無抑制活性，且活性測試表明 3-溴丙酮酸可能靶向MBLs 活性中心的半胱氨酸殘基，研究者推斷，3-溴丙酮酸可能通過親電性亞甲基與 NDM-1 活性部位的半胱氨酸硫醇形成共價結(jié)合以實現(xiàn)對 NDM-1 的可逆性抑制[29]。該推斷在接下來的硫醇化合物競爭實驗中得到了初步證實，硫醇化合物（如二硫蘇糖醇、半胱氨酸）與 3-溴丙酮酸同時使用可以恢復 NDM-1 的催化活性。

圖 2 與氨基酸殘基相互作用的抑制劑

2.2.4 1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷 1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷（1,4,7-triazacyclononane，TACN，圖 2）是歸屬于 NOTA和 1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（1,4,7,10- tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA）系列的環(huán)狀化合物。Somboro 等[30]發(fā)現(xiàn)，TACN 可恢復美羅培南對產(chǎn) B1 類 MBLs 的臨床分離菌株的抗菌活性，但對產(chǎn) SBLs 的菌株無明顯作用。酶活性實驗提示 TACN 對 NDM-1 的抑制作用呈濃度依賴性和時間依賴性，通過計算機模擬技術(shù)進一步分析 TACN 與 NDM-1 之間的相互作用，結(jié)果表明，TACN 可能通過氫鍵（His250和 Asp124）和疏水相互作用（His122、Asn220和 Trp93）與 NDM-1 結(jié)合從而抑制其催化活性[30]。

2.2.5 對氯汞苯甲酸和硝普鹽 對氯汞苯甲酸（p-chloromercuribenzoic acide，p-CMB，圖 2）和硝普鹽是 Thomas 等[31]基于高通量篩選模型從 LOPAC 化合物庫中篩選得到的兩個潛在 NDM-1 抑制劑，兩者均為硫醇修飾化合物。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，p-CMB 與 NDM-1 的共價結(jié)合與氨基酸 Cys208相關(guān)。然而，當研究者將 Asp 替代 NDM-1 活性部位的 Cys208，突變型 NDM-1 幾乎保持了完全的酶活性，但卻喪失了對 p-CMB 的反應性，這提示我們針對 NDM-1 中的 Cys 殘基進行藥物設(shè)計的策略可能存在局限性[31]。

2.3 同時作用于鋅離子和氨基酸殘基的抑制劑

2.3.1 雙環(huán)硼酸鹽 雙環(huán)硼酸鹽作為潛在廣譜 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑被多次報道，其作用機制為模擬 β-內(nèi)酰胺酶催化過程中的陰離子高能四面體中間體，抑制 SBLs/MBLs 的活性，在該過程中，硼酸鹽可能優(yōu)先以 sp2 雜化形式（硼原子）與 SBLs/MBLs 結(jié)合，以 sp3 形式（硼原子）形成穩(wěn)定的酶-抑制劑復合物[32-35]。雙環(huán)硼酸鹽的代表性化合物 VNRX-5133（taniborbactam，圖 3）與第四代頭孢菌素——頭孢吡肟的聯(lián)合用藥方案目前正處于 III 期臨床試驗階段[35]。Liu 等[35]在最近的研究中指出，VNRX-5133 對所檢測的 SBLs（如 KPC-2、AmpC、OXA-1/48）及 MBLs（NDM-1 和 VIM-2）均有較好的抑制活性。當 VNRX-5133 與頭孢吡肟聯(lián)合用藥時，VNRX-5133 可顯著提高頭孢吡肟對產(chǎn) SBLs/MBLs 革蘭氏陰性耐藥株的抗菌活性[35]。在中性粒細胞缺乏的小鼠肺部感染模型（產(chǎn) CTX-M-14 的肺炎克雷伯菌）和小鼠泌尿道上行感染模型（產(chǎn) CTX-M-15 的大腸桿菌）中，VNRX-5133 與頭孢吡肟聯(lián)合使用可分別降低肺部組織和腎內(nèi)的活菌數(shù)[35]。

2.3.2 卡托普利及其衍生物 卡托普利作為已上市的降血壓藥物，可通過巰基與 NDM-1 催化口袋的兩個鋅離子配位結(jié)合，通過羧基與 Asn220形成氫鍵，抑制 NDM-1 的活性（D-卡托普利，圖 3，IC50值為 7.9 μmol/L；L-卡托普利，圖 3，IC50值為 202.0 μmol/L）[36-38]。Li 等[39]在卡托普利結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進行設(shè)計優(yōu)化，合成的 3-巰基-2-甲基丙酸的芐酰胺衍生物化合物 22（圖 3）展現(xiàn)出對 NDM-1 較好的抑制作用，IC50值為 1.0 μmol/L。Meng 等[40]合成的衍生物 14m（圖 3）也可顯著抑制 NDM-1 的催化活性，IC50值為 0.12 μmol/L，與美羅培南聯(lián)合使用可顯著增強 NDM-1 陽性臨床分離菌株對美羅培南的敏感性。

2.3.3 蒽貝素 蒽貝素（圖 3）是從白花酸藤果中分離出的苯醌衍生物，Ning 等[41]首次報道了蒽貝素對 NDM-1 的抑制活性，IC50值為（2.1 ± 0.2）μmol/L，i 值為（0.19 ± 0.02）μmol/L。分子動力學研究表明，蒽貝素以其醌基部分與 NDM-1 結(jié)合，脂肪烴鏈部分則滯留在 NDM-1 催化口袋以外，蒽貝素與氨基酸殘基 Cys208和 Asp124形成的兩個氫鍵可能是其與 NDM-1 特異性識別與結(jié)合的分子基礎(chǔ)，此外，苯醌上的羥基可直接與 NDM-1 活性部位的 Zn2+配位結(jié)合[41]。蒽貝素可恢復多種 β-內(nèi)酰胺類抗生素對產(chǎn) NDM-1 的肺炎克雷伯菌 BAA-2146 的抗菌活性，當蒽貝素的濃度為 32 μg/ml 時，可分別使美羅培南、比阿培南和亞胺培南的 MIC 降低至原來的 1/512、1/128 和 1/256。

2.3.4 黃芩苷 黃芩苷（圖3）是從黃芩中提取的主要活性成分，對 NDM-1 有良好的抑制作用[IC50值為（3.89 ± 1.1）μmol/L][42]。分子對接結(jié)果顯示，黃芩苷可通過羧基直接作用于 NDM-1 活性部位的 Zn2+，并可與酶多處氨基酸殘基（Glu152、Gln123、Met67、Trp93和 Phe70）形成氫鍵[42]。進一步活性測試表明，黃芩苷可恢復 NDM-1 重組工程菌對頭孢呋辛及氨芐青霉素的敏感性，當黃芩苷濃度為64 μg/ml 時，可使兩者的 MIC 降低至原來的 1/16。

圖 3 同時作用于鋅離子和氨基酸殘基的抑制劑

2.3.5 三唑硫代乙酰胺類化合物 Zhang 等[43]在 2014 年報道二芳基取代的唑基硫代乙酰胺衍生物（圖 3）對 NDM-1有抑制作用（i < 7 μmol/L），其三唑基團可與 NDM-1 活性中心的鋅離子配位結(jié)合。2016 年該團隊以三唑硫代乙酰胺為骨架合成的 24 個三唑硫代乙酰胺類化合物均對 NDM-1 有抑制活性，IC50值為 0.15 ~ 1.90 μmol/L[44]。分子對接結(jié)果表明，其代表性化合物 4d 和 6c 的三唑環(huán)可與 NDM-1 活性部位的 Zn1 和 Zn2 直接作用，酰胺鍵可與氨基酸 Lys211（Lys224）相互作用，以此形成與 NDM-1 的穩(wěn)定結(jié)合[44]。該團隊在 2019 年再次發(fā)表研究，揭示了鹵代三唑硫代乙酰胺作為 MBLs 抑制劑的潛能，其中氯代化合物 1、2、3 對 NDM-1 有抑制作用，IC50值低于0.96 μmol/L[45]。

2.3.6 ZINC84525623 ZINC84525623（圖 3）是 Rehman 等[46]利用高通量虛擬篩選技術(shù)在 ZINC 庫中發(fā)現(xiàn)的潛在 NDM-1 抑制劑，其通過與氨基酸Gln123、Asp124、Lys211和 Asn220形成氫鍵，與 Zn2 和 Asp124形成靜電作用，與 His250等氨基酸殘基形成疏水相互作用而與 NDM-1 酶活性中心穩(wěn)定結(jié)合。在 IC50檢測實驗中，ZINC84525623 展現(xiàn)出略低于 D-卡托普利的抑制活性，可使 NDM-1 的催化效能（cat/m）降低至原來的 1/3.13 ~ 1/7.37[46]。

2.4 抑制 NDM-1 表達的抑制劑

不同于以往 NDM-1 抑制劑的篩選和設(shè)計理念，Sully 等[47]構(gòu)建靶向 NDM-1 mRNA 的肽偶聯(lián)磷酸二酰胺嗎啉低聚物（peptide-conjugated phosphorodiamidate morpholino oligomer，PPMO），從基因水平干預 NDM-1 的表達。體外活性檢測結(jié)果表明，NDM-1 PPMO 可抑制NDM-1 的表達，繼而恢復 NDM-1 陽性菌株對碳青霉烯類藥物的敏感性。在表達NDM-1 的大腸桿菌 CVB-1 感染的小鼠膿毒癥模型中，PPMO 與美羅培南聯(lián)合使用可顯著提高感染小鼠的生存率，降低血液和脾臟中的細菌負荷，緩解炎癥反應[47]。

2.5 機制尚不明確的抑制劑

2.5.1 植物葉片提取物 Chandar 等[48]通過對 240 種藥用植物葉片的乙醇提取物進行篩選，得到來自石榴、大麻槿、酸角等 6 種植物的提取物對 NDM-1 具有體外抑制活性，IC50值在 0.50 ~ 1.2 ng/μl 之間。除對 NDM-1 有抑制活性外，這 6 種化合物還可通過破壞細菌細胞壁的完整性來發(fā)揮抗菌作用。當分別與黏菌素、美羅培南和四環(huán)素聯(lián)合給藥時，6 種化合物均發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，（fractional inhibitory concentration index，為 0.09 ~ 0.375[48]。然而，上述提取物的抗菌活性是否為多種化合物的組合或源于某單個高效化合物仍需進一步確證。

2.5.2 ANT431 ANT431（圖4）是基于苗頭化合物吡啶-2-羧酸進行設(shè)計修飾所得到的MBLs 特異性抑制劑[49]。ANT431 可競爭性抑制 NDM-1 和 VIM-2 的活性，i 值分別為0.29 和 0.195 μmol/L[49]。當 ANT431 濃度為 30 μg/ml 時，可顯著提高美羅培南對重組 NDM-1/VIM-2 表達工程菌的活性，并可使美羅培南對 79% 所檢測的 NDM-1 陽性臨床分離菌株的 MIC 降低至藥敏水平：2 μg/ml。在產(chǎn) NDM-1 的臨床分離大腸桿菌IR3 感染的小鼠大腿感染模型中，ANT431 與美羅培南聯(lián)合用藥可顯著降低感染大腿的細菌負荷。與體內(nèi)其他金屬酶如 ACE 相比，ANT431 對 MBLs 具有良好的選擇性，且藥代動力學參數(shù)良好，顯示出較高的成藥潛能[49]。遺憾的是，研究者并未詳細闡述 ANT431 發(fā)揮 NDM-1 抑制活性的分子機制，其具體作用方式有待進一步探討。

ANT431

3 展望

近年來，NDM-1 及其變異體在包括中國在內(nèi)的眾多國家迅速擴散，這不僅歸因于其在不同菌種間的高頻轉(zhuǎn)移，也與旅行、衛(wèi)生等人為因素息息相關(guān)[50]。盡管在過去的幾年中，研究者圍繞 NDM-1 的結(jié)構(gòu)特征、生物學功能和作用機制展開了一系列研究，但至今沒有可用于臨床的 NDM-1 特效抑制劑，攜帶 NDM-1 的臨床相關(guān)細菌儼然已成為治療感染性疾病的巨大威脅[4]。

隨著由 NDM-1 導致的細菌耐藥問題日益嚴峻，積極尋找高效抑制劑輔助 β-內(nèi)酰胺類抗生素治療成為對抗產(chǎn) NDM-1 耐藥細菌的重要策略[50]。然而，縱觀 NDM-1 抑制劑的研發(fā)歷程，研究者頻頻受挫，其中，催化機制不清是阻礙抑制劑研發(fā)的重要因素。NDM-1 的活性位點位于一個由柔性環(huán)（L3 和 L10）限定的寬而淺的槽中，促使酶具備與廣泛底物結(jié)合的特征，然而，NDM-1 與不同底物的具體結(jié)合模式不甚相同，結(jié)合位點具有可塑性，為抑制劑靶向目標的確立增加了難度[4, 51]。

目前，既能螯合 NDM-1 活性部位的鋅離子，又能與結(jié)合位點的氨基酸殘基形成氫鍵和（或）鹽橋的分子被認為是最具潛力的 NDM-1 抑制劑[4]。盡管螯合 NDM-1 活性部位的鋅離子常常被作為篩選和設(shè)計 NDM-1 抑制劑的重要策略，但由于依賴鋅離子的酶在人體內(nèi)廣泛存在，基于此策略得到的化合物的“脫靶效應”仍需慎重考量和規(guī)避；同時，NDM-1 的突變正趨向于增強體內(nèi)鋅離子親和力，提高對鋅離子缺乏的耐受，為未來抑制劑的研發(fā)擲出了新的難題[52]。雙環(huán)硼酸鹽類化合物 VNRX-5133 與頭孢吡肟的聯(lián)合用藥方案已進入 III 期臨床試驗階段，這為科研工作者們提供了新的思路，即通過模擬 β-內(nèi)酰胺類抗生素水解過程中的四面體中間體有望實現(xiàn)對 SBLs 和 MBLs 的雙重抑制。

隨著生物學、藥物化學等多學科知識與技術(shù)的發(fā)展，NDM-1 與底物的作用模式及規(guī)律有望得到更精確、更完善的闡述，從而助力 NDM-1 抑制劑的研發(fā)，緩解“超級細菌”的耐藥現(xiàn)狀。

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國家自然科學基金面上項目（81872913）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863 計劃）（2015AA 020911）

劉憶霜，Email：liuys@imb.pumc.edu.cn

2020-04-03

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.009