蔡 波，邢娟娟，胡 蓉，任 欣，王 榕，吳恬寧，郭 菲*，陳少卿

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 燒傷中心， 江西 南昌 330006； 2.南昌大學(xué) 江西醫(yī)學(xué)院， 江西 南昌 330006；3.南昌大學(xué)附屬中學(xué)， 江西 南昌 330029； 4.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科， 江西 南昌 330006)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是指發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁黏膜上皮的惡性腫瘤，具有明顯的地理和種族分布特征，尤其是在東南亞和中國南部高發(fā)，在流行地區(qū)為最常見的致死性惡性腫瘤[1]。鼻咽癌的發(fā)生與多因素相關(guān)，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是成功治療NPC的主要障礙[2]。目前放療是鼻咽癌的首選治療方法，但放化療的毒副作用最大程度限制了其療效，因此，尋找一種低毒又高效的抗鼻咽癌藥物尤其重要。研究顯示，組蛋白甲基化表觀遺傳失調(diào)已被證實(shí)為惡性腫瘤的一大特征，參與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制[3]。三甲基組蛋白H3K27(H3K27me3)廣泛分布于全基因組中，尤其在沉默基因的啟動(dòng)子區(qū)域大量存在，通常參與靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制[4]。GSK-J4是組蛋白H3K27me3/2 去甲基化酶JMJD3和UTX的新型選擇性抑制劑，因其作用濃度低(微摩爾),對(duì)正常細(xì)胞幾乎無毒性及其可逆性修飾優(yōu)勢(shì)，而在多種類型腫瘤中被用于研究[5]，它可以通過細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制細(xì)胞增殖，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)特性[6-7]。本研究利用GSK-J4特異性抑制鼻咽癌CNE-1細(xì)胞內(nèi)去甲基化酶，以觀察CNE-1細(xì)胞增殖能力的變化并探索其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1(江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。

1.1.2 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone公司)；胰蛋白酶、PBS和CCK-8試劑盒(FC101)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；DAPI染色試劑盒(Bioworld Technology公司)；RNAiso Plus、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qRCR試劑盒(TaKaRa公司)；PI和RNase A(BD公司)；組蛋白H3K27去甲基化酶抑制劑GSK-J4(Selleck公司)；兔單克隆抗人H3K27me3抗體(CST公司)；山羊多克隆抗兔抗體(Alexa Flour?488)(Abcam公司)；CyclinD1、Ki-67和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物(華大基因科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將CNE-1細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞。將CNE-1細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組, 對(duì)照組細(xì)胞給予含等體積溶劑DMSO(<0.1% v/v)的完全培養(yǎng)基處理,實(shí)驗(yàn)組用含0.5 mmol/L GSK-J4的完全培養(yǎng)基處理，分別于24、48和72 h，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.2 激光掃描共聚焦技術(shù)檢測CNE-1細(xì)胞內(nèi)H3K27me3蛋白的表達(dá)水平：將CNE-1細(xì)胞調(diào)整為5×104個(gè)/mL，接種爬片，設(shè)陰性組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。貼壁后，對(duì)照組和陰性組均加入含DMSO的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加含0.5 mmol/L GSK-J4的完全培養(yǎng)基,48 h后檢測細(xì)胞內(nèi)H3K27me3蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，隨后用0.5% Triton X-100透化10 min，2% BSA封閉30 min，再將細(xì)胞與相應(yīng)的一抗在37 ℃下孵育2 h(陰性組加入2% BSA), PBS洗滌后，與Alexa Flour 488綴合的山羊抗兔抗體在37 ℃下孵育1 h，DAPI室溫下復(fù)染15 min, PBS洗3次。最后將爬片倒置放在共聚焦顯微鏡觀察。隨機(jī)取每張爬片不重復(fù)的5個(gè)位置于鏡下拍照，得到圖片用OLYMPUS cellSens 1.16軟件分析其吸光度。

1.2.3 RT-qPCR檢測各組細(xì)胞中cyclinD1和Ki-67 mRNA水平：取每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，隔日各實(shí)驗(yàn)組加相應(yīng)條件培養(yǎng)基處理。24 h后用RNAiso Plus提取各組細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA的純度和濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒在20 μL反應(yīng)體系下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測細(xì)胞中cyclinD1和Ki-67 mRNA水平。cyclinD1上游引物為5′-TTGACTGCCGAGA AGTTGTG-3′,下游引物為5′-CTGGCATTTTGGAG AGGAAG-3′；Ki-67上游引物為5′-GCCAAGAACGC CTAAGGAAG-3′,下游引物為5′-TGGTGGAGATTTG CAGGCTA-3′；GAPDH上游引物為5′-CAGGGCTG CTTTTAACTCTGGT-3′,下游引物為5′-GATTTTGG AGGGATCTCGCT-3′。以GAPDH為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火與延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣3個(gè)復(fù)孔，采用Δ循環(huán)閾值(Ct)法處理結(jié)果，計(jì)算各組細(xì)胞中各指標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量，即2-ΔΔCt。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測定CNE-1細(xì)胞內(nèi)H3K27me3的表達(dá)水平及觀察細(xì)胞周期分布

1.2.4.1 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測定CNE-1細(xì)胞內(nèi)H3K27me3的表達(dá)水平:將CNE-1細(xì)胞按每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁，各組換相應(yīng)條件培養(yǎng)基處理72 h。胰蛋白酶消化離心后用4%多聚甲醛室溫固定10 min，再用甲醇于-20 ℃重懸20 min，洗滌后用2% BSA封閉30 min。各實(shí)驗(yàn)組加入相應(yīng)一抗孵育液室溫孵育40 min (陰性組加入2% BSA)，根據(jù)分組，在陰性組和各實(shí)驗(yàn)組中加入二抗孵育液山羊多克隆抗兔抗體室溫避光孵育40 min。最后以4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，2% BSA洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測H3K27me3的表達(dá)情況，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4.2 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)觀察CNE-1細(xì)胞周期分布:分組和處理同上，消化收集實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。PBS洗滌后加入于-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定。離心洗滌后，經(jīng)PI染液(含50 mg/L PI, 10 mg/L RNase A)懸浮細(xì)胞，室溫避光孵育15 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，檢測結(jié)果用Flowjo v10軟件分析，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 CCK-8檢測人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的增殖活性：根據(jù)試劑說明書，人巨噬細(xì)胞GSK-J4的IC50值為9 mmol/L，據(jù)此本實(shí)驗(yàn)用含不同濃度GSK-J4(0～4 mmol/L)的完全培養(yǎng)基孵育CNE-1細(xì)胞。將CNE-1細(xì)胞接種于96孔板中，每孔3 000個(gè)細(xì)胞。貼壁后分別換上含0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol/L的GSK-J4處理細(xì)胞48和72 h, 含DMSO組為對(duì)照組，而沒有細(xì)胞的組(只加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基)充當(dāng)陰性組，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，放孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。GSK-J4分別作用48和72 h后, 按試劑盒說明書操作，檢測各組在450 nm處的吸光度(A)。細(xì)胞存活率(%)= [實(shí)驗(yàn)孔的A值- 陰性組孔A值/對(duì)照孔的A值- 陰性組孔A值]×100%。

1.2.6 細(xì)胞平板集落實(shí)驗(yàn)觀察CNE-1細(xì)胞集落形成能力：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)條件培養(yǎng)基處理72 h，重新消化接種6孔板，每孔500個(gè)細(xì)胞，換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，最后按平板集落形成實(shí)驗(yàn)常規(guī)處理。拍照后用Adobe Photoshop CS6計(jì)數(shù)大于或者等于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)量，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GSK-J4作用后細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3K27me3水平明顯上調(diào)

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3K27me3的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)(圖1，表1)。

圖1 GSK-J4作用48 h后細(xì)胞內(nèi)H3K27me3蛋白的表達(dá)Fig 1 Expression of H3K27me3 protein in cells after 48 hours of GSK-J4

表1 培養(yǎng)48 h后細(xì)胞內(nèi)H3K27me3的表達(dá)水平

2.2 GSK-J4顯著抑制細(xì)胞內(nèi)cyclinD1和 Ki-67 mRNA水平

實(shí)驗(yàn)組(0.5 mmol/L GSK-J4)細(xì)胞中cyclinD1和 Ki-67 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)(表2)。

表2 GSK-J4處理24 h后細(xì)胞中cyclinD1和Ki-67 mRNA水平

2.3 GSK-J4明顯抑制CNE-1細(xì)胞增殖活性和克隆形成能力

各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活力和對(duì)照組相比較明顯下降(P<0.05)，并且抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系(表3)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成數(shù)目[ (313.3±1.5) 個(gè)]明顯低于對(duì)照組[(436.3±16.3)個(gè)](P<0.05)(圖2)。

表3 細(xì)胞生存率

A.control group; B.experimental group(0.5 mmol/L GSK-J4)圖2 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Cell colony formation experimental results

2.4 GSK-J4處理可以延長CNE-1細(xì)胞G0/G1期并縮短細(xì)胞S期

實(shí)驗(yàn)組(0.5 mmol/L GSK-J4)G0/G1期細(xì)胞數(shù)百分比與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)，而S期細(xì)胞數(shù)百分比與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)(表4)。

表4 GSK-J4處理48 h后細(xì)胞周期分布變化

3 討論

細(xì)胞增殖受嚴(yán)格的細(xì)胞周期調(diào)控，局部組織的細(xì)胞內(nèi)某些基因表達(dá)水平的異常改變會(huì)失去對(duì)其增殖的正常調(diào)控，導(dǎo)致克隆性異常增生，無限增殖是腫瘤細(xì)胞顯著的基本特征之一。

組蛋白是一種小分子堿性蛋白質(zhì)，為真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)成分之一，在相關(guān)酶的作用下可以發(fā)生甲基化和去甲基化修飾，調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)和基因表達(dá)，從而調(diào)控組織細(xì)胞的分化和發(fā)育[8]。組蛋白H3K27廣泛分布于全基因組中，其在細(xì)胞內(nèi)甲基化水平主要受到組蛋白H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶(EZH2)和去甲基化酶(UTX/JMJD3)共同作用來維持穩(wěn)定。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，組蛋白H3第27位賴氨酸殘基的三甲基化(H3K27me3)作為抑制性標(biāo)記在人類多種癌(如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和食管癌)的發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，并與患者預(yù)后相關(guān)，組蛋白甲基化表觀遺傳調(diào)控失調(diào)已被證實(shí)參與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制[9]。GSK-J4是一種新型的特異性組蛋白H3K27去甲基化酶JMJD3和UTX的小分子抑制劑，最近被證實(shí)可以通過抑制組蛋白H3K27me3去甲基化，顯著性抑制多種腫瘤的增殖，卻對(duì)正常細(xì)胞毒性很小，甚至無毒性，如膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等[10-11]。這與本實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果一致，即通過GSK-J4處理人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)H3K27me3蛋白表達(dá)上升，同時(shí)顯著性抑制CNE-1細(xì)胞體外增殖能力。

細(xì)胞周期調(diào)控在細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞周期蛋白cyclinD1在正常細(xì)胞周期中參與DNA合成，促使細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)換，常被認(rèn)作為一種原癌基因[12]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，GSK-J4對(duì)組蛋白去甲基化酶的抑制作用影響了細(xì)胞活力和細(xì)胞周期進(jìn)程，而且誘導(dǎo)細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)改變的機(jī)制和能力因細(xì)胞的類型而有所不同[13]。Ki-67作為一種表達(dá)貫穿增殖期細(xì)胞的核抗原，在細(xì)胞有絲分裂的各期均有表達(dá)，是目前臨床較為肯定的核增殖標(biāo)志基因。研究表明，鼻咽癌組織中Ki-67呈高表達(dá)狀態(tài)，在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用[14]。本研究通過檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中cyclinD1和Ki-67 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CNE-1細(xì)胞經(jīng)GSK-J4作用24 h后，細(xì)胞內(nèi)cyclinD1和Ki-67 mRNA的表達(dá)水平均顯著性下降。同時(shí)流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)GSK-J4處理后，細(xì)胞在G0/G1期阻滯。提示GSK-J4可能是通過下調(diào)cyclinD1、Ki-67的表達(dá)水平,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制CNE-1細(xì)胞增殖。目前，鼻咽癌的治療仍然是以放療為主，但放療抗性已被確認(rèn)為放療失敗的主要原因[15]。其次，任何形式的放療都不可避免地存在一定的毒副作用，最大程度限制了其療效。近年來，表觀遺傳學(xué)在腫瘤治療中獲得重大進(jìn)展，但在鼻咽癌治療的研究方面卻非常少見，有文獻(xiàn)[9]對(duì)H3K27me3在NPC中的表達(dá)動(dòng)力學(xué)及其臨床病理學(xué)和預(yù)后進(jìn)行了報(bào)道，但未進(jìn)一步對(duì)相應(yīng)生物學(xué)現(xiàn)象和分子機(jī)制進(jìn)行研究。本研究通過調(diào)控表觀遺傳學(xué)修飾，揭示了GSK-J4抑制鼻咽癌細(xì)胞體外增殖的可能機(jī)制，為臨床鼻咽癌的治療提供理論依據(jù)和新靶點(diǎn)。但GSK-J4能否在蛋白水平也下調(diào)cyclinD1和Ki-67的表達(dá)以及cyclinD1和Ki-67 mRNA表達(dá)下降是否與GSK-J4上調(diào)細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3K27甲基化水平有直接關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。