喬國峰，李紅麗，王國艷，孟 帆，米瑞娟，張國權(quán)，王志宇，孫仰介，薛俊龍，劉 源，薛翼鵬

（山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西太原030032）

圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科，由4種豬圓環(huán)病毒（PCV）組成（PCV1、PCV2、PCV3和PCV4）。PCV1于1974年被發(fā)現(xiàn)是豬腎（PK-15）細胞系的污染物，是豬的非致病性病毒[1]。20世紀90年代，PCV2被發(fā)現(xiàn)并隨后與一系列綜合征相關(guān)，統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病（PCVD）[2]。2016年，在美國發(fā)現(xiàn)了PCV3，其臨床癥狀與豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）相關(guān)[3]，并患有心臟和多系統(tǒng)炎癥[4]。之后，在亞洲、歐洲和南美洲在內(nèi)的世界范圍內(nèi)都有報道[5]。PCV3具有一個環(huán)狀的單鏈DNA（SsDNA）基因組，長度約為2 000個核苷酸，2個主要的ORF在相反的方向上，編碼衣殼（Cap）和復制酶（Rep）蛋白[3-4]。據(jù)報道，PCV3與不同的臨床/病理條件有關(guān)，包括豬皮炎和腎病綜合征、生殖障礙、呼吸問題、腹瀉以及多系統(tǒng)炎癥和心肌炎[5-12]。有研究表明，在有類似PDNS癥狀的豬和臨床無癥狀豬的血清中均檢測到了PCV3，證明該病毒存在致病潛力[13]。山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所預防獸醫(yī)研究室在母豬的混合血清樣本中發(fā)現(xiàn)了PCV3基因組，為了搞清母豬血清中PCV3的存在是否與死產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)，采集了分娩后死產(chǎn)母豬與無死產(chǎn)母豬的血清，調(diào)查PCV3的感染率和DNA載量，為更深入地研究PCV3與死產(chǎn)發(fā)生的聯(lián)系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集2020年5—8月山西臨汾、長治地區(qū)6個規(guī)?；B(yǎng)豬場中剛生產(chǎn)的母豬血液。樣本被分成2組：一組是產(chǎn)時至少有1頭死產(chǎn)仔豬的母豬（46頭）血清，另一組是沒有死產(chǎn)仔豬的母豬（43頭）血清。所有母豬在臨床上都是健康的。

1.1.2 主要試劑 柱式DNA提取試劑盒購自上海凡濟生物科技有限公司；TOPO質(zhì)粒和2×Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG購自Invitgen公司；BL21感受態(tài)細胞購自北京博邁德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用柱式DNA提取試劑盒從200μL的血清中提取脫氧核糖核酸。用微量分光光度法驗證DNA的質(zhì)量。

1.2.2 PCV3的實時熒光定量PCR檢測 參照GenBank中公布的PCV3全基因序列設(shè)計1對引物，并用Primer BLAST軟件進行計算機評價，驗證引物的特異性。引物正向序列為5′-AACGGTGGG GGGTCATATGTGTTG-3′，反向序列為5′-AGACGA CCCTTATGCGGAAA-3′（基因組位置1441-1616），擴增片段大小為175 bp。通過在TOPO質(zhì)粒（Invitgen）中克隆擴增子，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌（BL21）所獲得的標準曲線來評估qPCR的檢測限。提取質(zhì)粒并定量，并用DNA分子構(gòu)建1×108～1×100的標準曲線。反應的最終體積為12.5μL，循環(huán)條件為：50℃2 min，95℃2 min，擴增40個循環(huán)（95℃15 s和60℃30 s）。通過逐漸升高溫度（0.3℃）60～95℃繪制熔化曲線，通過與標準曲線的比較來確定病毒DNA的拷貝數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

用卡方檢驗比較了有死產(chǎn)仔豬和無死產(chǎn)仔豬母豬之間PCV3感染的發(fā)生率。用Wilcoxon-Mann-Whitney U檢驗比較病毒DNA載量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV3感染率分析

經(jīng)BLAST分析，qPCR具有特異性，定量限為10個拷貝數(shù)的PCV3 DNA，效率為99.4%。然而，也檢測到了低于10個拷貝數(shù)的DNA含量，盡管不能量化。因此，證明陽性樣品的標準是任何循環(huán)閾值低于39、比熔體溫度為83.4℃的樣品。陰性對照沒有產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，所有DNA樣品都顯示出良好的質(zhì)量，A260/A280和A260/A230的比值分別高于1.8和2.0。在檢測的89個樣本中，57個（64%）被發(fā)現(xiàn)含有PCV3基因組。有死產(chǎn)母豬陽性率為67.4%（31/46），無死產(chǎn)母豬陽性率為60.5%（26/43），2組間差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.45）。所有被檢測的養(yǎng)殖場的樣本都檢測到了病毒基因組（圖1）。

所有養(yǎng)殖場的2組均檢測到PCV3 DNA，除第3場分娩正常（無死胎）的母豬血清中未檢測到PCV3 DNA外，其余均檢出PCV3 DNA。

2.2 PCV3 DNA載量分析

在3號養(yǎng)殖場中，所有分娩正常（無死胎）的母豬均未檢測到PCV3。在含有PCV3基因組的57份血清中，只有25份具有可量化的基因組載量，即高于10拷貝/mL的基因組，這是qPCR的定量極限。在這25個樣本中，14個對應于有死產(chǎn)的母豬，而11個對應于沒有死產(chǎn)的母豬（圖2）。對比有死胎和無死胎的母豬，每mL血清中檢測到的DNA分子的中間值分別為676和851。在比較2組間的PCV3基因組載量時，沒有發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的差異（Wilcoxon-Mann-Whitney U；P＝0.92）。

3 討論

SHANG等[14]研究表明，只有在產(chǎn)死胎的母豬身上發(fā)現(xiàn)了PCV3基因組，但PCV3感染和死胎的發(fā)生之間沒有明確的聯(lián)系。本研究設(shè)計了一種定量PCR來檢測PCV3感染率和血清中的病毒DNA載量。該方法具有99.4%的效率，能夠在高通量測序（HTS）中檢測到先前陰性的樣本中的PCV3 DNA。在之前的檢測結(jié)果中，可能由于PCV3 DNA載量過低的原因，有一定的誤差，因此，該檢測技術(shù)為后期的研究提供了更加靈敏的檢測手段。

然而，在與PCV3感染之間的明確關(guān)聯(lián)已經(jīng)在有生殖障礙的豬中被報道，如流產(chǎn)和死胎豬[4-6]。事實上，在木乃伊胎兒中，報告了很高的混合感染率，包括豬細小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒2（PCV2）和鉤端螺旋體（Leptsp.），但沒有闡明PCV3在這種情況下的作用。相比之下，其他研究報告了PCV3在健康動物中的感染率，在某些情況下，PCV3的感染率高于患病動物[15-16]。

在本研究中，無論有沒有死產(chǎn)母豬的血清中都發(fā)現(xiàn)了PCV3基因組。在3號養(yǎng)殖場中，所有10頭分娩正常的母豬在它們的血清中都沒有PCV3感染，可能是一個例外，因為其他農(nóng)場在2組中都有PCV3感染的母豬。本研究結(jié)果顯示，有或無死胎母豬血清中PCV3 DNA載量無顯著差異，提示PCV3可能與母豬死產(chǎn)的發(fā)生無關(guān)。但值得注意的是，被檢查的血清是從剛剛分娩的母豬身上采集的，PCV3感染可能發(fā)生在懷孕早期或更早的時期，在妊娠的前幾個階段感染一些其他感染源，也會導致死產(chǎn)。對PCV3感染在整個孕期以及在新近出生和死產(chǎn)的仔豬中的作用應進一步研究，可能會提供有關(guān)該病毒導致死產(chǎn)的更多數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

通過對母豬血清中PCV3基因組的鑒定，本研究提供了剛產(chǎn)下的母豬感染PCV3的證據(jù)。死產(chǎn)的發(fā)生似乎與PCV3感染率或分娩時母豬的PCV3基因組載量無關(guān)。