夏 陽 李靜喆 馬守成 蘇 飛 段 玲

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)作為我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率每年遞增約4%，具有發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn)[1]。盡管外科手術(shù)、化療、放療、靶向治療、免疫治療等綜合治療手段飛速發(fā)展，但CRC患者總體預(yù)后仍不盡如人意[2]。因此，結(jié)直腸癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，起初被認(rèn)為是DNA轉(zhuǎn)錄過程中的垃圾而備受冷落[3]。近年來，隨著研究的深入，lncRNA被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-7]。因此，lncRNA作為腫瘤治療的靶點(diǎn)具有廣泛應(yīng)用前景。LINC01560屬基因間lncRNA，位于X染色體p11.3。Ming等[8]發(fā)現(xiàn)LINC01560在骨肉瘤中高表達(dá)。但目前尚未見到LINC01560在結(jié)直腸癌方面的研究報(bào)道。因此，本研究擬采用qRT-PCR檢測(cè)LINC01560在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，為今后進(jìn)一步研究其作為ceRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織樣本 收集2018年01月至2019年6月在蘭州市第一人民醫(yī)院、蘭州大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)切除的37例結(jié)直腸癌(coloerctal cancer，CRC)患者的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>2 cm)標(biāo)本。采集的樣本于液氮保存，經(jīng)病理切片確診為CRC。所有患者術(shù)前未進(jìn)行放療、化療等抗腫瘤治療。患者簽署知情同意書，研究方案均獲得所在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞系與主要試劑 人結(jié)直腸癌癌細(xì)胞系(HCT116、NCI-H716、HRC-99)及正常結(jié)直腸細(xì)胞系FHC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司、雙抗(青霉素-鏈霉素)購(gòu)自上海碧云天公司；Lipofectamine 2000 Trizol試劑、RT-PCR相關(guān)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 StarBase數(shù)據(jù)庫分析 利用StarBase數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析LINC01560在結(jié)直腸癌組織與相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116、NCI-H716、HRC-99和FHC均在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素G和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度大約為80%時(shí)用胰酶消化進(jìn)行傳代。在6孔培養(yǎng)板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 收集細(xì)胞，根據(jù)Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Super Script First Strand cDNA Synthesis Kit將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過7300 Applied Biosystems實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，使用Sybr Green 2×PCR Master Mix，選擇GAPDH作為內(nèi)參照檢測(cè)細(xì)胞中LINC01560的表達(dá)量。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。每份樣品重復(fù)測(cè)量3次。檢測(cè)引物序列見表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)引物及其序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LINC01560在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織中的表達(dá)

網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫StarBase數(shù)據(jù)庫檢索顯示，471例CRC組織中，LINC01560表達(dá)水平為(3.512±2.439)，明顯高于41例癌旁組織(1.367±1.218)，差異顯著(P<0.05，圖1A)。在新收集的37對(duì)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)LINC01560在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。

2.2 LINC01560結(jié)直腸癌細(xì)胞系、正常結(jié)直腸細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞系相比，LINC01560在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.3 LINC01560表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

依據(jù)LINC01560mRNA表達(dá)的中位數(shù)，將37例結(jié)直腸癌患者分為L(zhǎng)INC01560高表達(dá)組(n=26)和LINC01560低表達(dá)組(n=11)，發(fā)現(xiàn)LINC01560表達(dá)與性別、年齡、分化程度、CEA表達(dá)水平等均無明顯相關(guān)性，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、部位等明顯相關(guān)(P<0.05)，見表2。

圖1A LINC01560在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)

圖1B LINC01560在結(jié)直腸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)

圖2 LINC01560在結(jié)直腸癌細(xì)胞系和正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 結(jié)直腸癌患者LINC01560表達(dá)水平的單因素和多因素分析

對(duì)患者的臨床病理指標(biāo)進(jìn)行單因素和多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，結(jié)果顯示，在單因素分析中，腫瘤部位、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與LINC01560表達(dá)水平存在顯著差異。而在多因素分析中，通過調(diào)整因素的影響，腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與LINC01560表達(dá)水平的“假關(guān)聯(lián)”消失，TNM分期成為1個(gè)影響結(jié)直腸癌患者LINC01560表達(dá)水平的顯著的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表3。

2.5 LINC01560表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者生存期的相關(guān)性

網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫StarBase數(shù)據(jù)庫分析顯示，131例高表達(dá)LINC01560的結(jié)直腸癌患者和132例低表達(dá)LINC01560的結(jié)直腸癌患者比較，Log-Rank檢驗(yàn)顯示：LINC01560高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者生存期要明顯低于LINC01560低表達(dá)組(P=0.02)，Cox回歸分析顯示，LINC01560的風(fēng)險(xiǎn)比(Hazard Ratio，HR，95%CI)為1.60，見圖3。提示結(jié)直腸癌患者高表達(dá)LINC01560時(shí)，總體預(yù)后更差，LINC01560高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的因素。

表2 結(jié)直腸癌患者LINC01560表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

哺乳動(dòng)物基因組序列中，4%～9%的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA[9](相應(yīng)的蛋白編碼RNA的比例是1%)。lncRNA與小分子RNA相比，序列更長(zhǎng)，空間結(jié)構(gòu)也較為復(fù)雜，參與表達(dá)調(diào)控的機(jī)制也更具有多樣性和復(fù)雜性。盡管目前只有小部分的功能性lncRNA被報(bào)道，但可以明確的是，lncRNA能通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與包括基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸在內(nèi)的多種重要的調(diào)控過程，在人類疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[10-13]。根據(jù)目前的研究，lncRNA的作用機(jī)制主要有以下幾種：①編碼蛋白的基因上游啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄，干擾下游基因的表達(dá)；②介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)及組蛋白修飾從而影響下游基因的表達(dá)；③與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切；④在Dicer酶的作用下產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA；⑤作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；⑥與特定蛋白質(zhì)結(jié)合，改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的細(xì)胞定位，參與調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；⑦作為小分子RNA(如miRNA、piRNA)的前體分子參與調(diào)控作用。近年來，lncRNA在腫瘤中的機(jī)制研究備受追捧[14-15]。

表3 結(jié)直腸癌患者LINC01560表達(dá)水平的單因素和多因素分析

圖3 LINC01560與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

結(jié)直腸癌是惡性程度較高的消化道腫瘤之一。全球范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌在男性的發(fā)病率僅次于肺癌和前列腺癌，在女性中僅次于乳腺癌居第二位[16]。結(jié)直腸癌已成為發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一[17]。研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)lncRNA參與了結(jié)直腸癌的演進(jìn)過程：如MYLKP1[18]、CCAT1[19]、CCAT2[20]、KCNQ1OT1[21]、MALAT1[22]等在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，顯示出原癌基因的特性；而例如MEG3[23]、Rp11-462C24.1[24]、ncRuPAR[25]等則在癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，顯示出抑癌基因的作用。

本研究利用結(jié)直腸癌組織樣本和細(xì)胞系分析發(fā)現(xiàn)LINC01560在結(jié)腸癌組織或細(xì)胞系中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織或細(xì)胞。通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析了LINC01560與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果顯示，LINC01560表達(dá)量與患者性別、年齡、組織分化程度、CEA表達(dá)水平等均無明顯相關(guān)，但與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位顯著相關(guān)。TNM分期是影響結(jié)直腸癌患者LINC01560表達(dá)水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示LINC01560可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，有助于結(jié)直腸癌的基因診斷及治療。本研究不足之處是未能進(jìn)一步驗(yàn)證LINC01560如何作為ceRNA通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合micRNA應(yīng)答元件參與靶基因的表達(dá)調(diào)控來調(diào)節(jié)CRC的進(jìn)程。后續(xù)實(shí)驗(yàn)希望能采用RNA-蛋白免疫共沉淀技術(shù)、Luciferase實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步探討述LINC01560作為ceRNA調(diào)控結(jié)直腸癌增殖、侵襲的分子機(jī)制。