裴銀輝，張 杰（華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 0630；唐山弘慈醫(yī)院綜合內(nèi)科，河北 唐山 06300）

2019年12月，在武漢發(fā)現(xiàn)了由新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染的肺炎疫情，國務(wù)院隨即將新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）納入法定傳染病。此次SARS-CoV-2是一種以前尚未在人類中發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒。2020年1月6日，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所成功自臨床患者分離并培養(yǎng)出病毒，1月27日通過國家病原微生物資源庫上傳病毒電鏡照片，隨后發(fā)布了SARS-CoV-2核酸檢測的引物序列和熒光探針[1]。此后，我國各版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》中將核酸檢測作為診斷和解除醫(yī)學(xué)隔離的重要實驗室指標(biāo)[2]。但近段時間來，陸續(xù)有多個COVID-19患者治愈后康復(fù)期核酸檢測轉(zhuǎn)陽的報道[3]，分析核酸轉(zhuǎn)陽的可能原因及對策，可為后續(xù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》的修訂及疫情防控決策提供參考。

1 核酸檢測轉(zhuǎn)陽的可能原因

1.1 實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptasepolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測技術(shù)因素

國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的各版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)為咽拭子實時熒光RT-PCR核酸檢測陽性，出院標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)2次（至少間隔24 h）呼吸道標(biāo)本核酸檢測陰性。SARS-CoV-2屬套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）中的冠狀病毒屬（Coronavirus）。實時熒光RT-PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針，選擇針對冠狀病毒屬高度保守的開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleoprotein，N）2個基因區(qū)域的引物擴(kuò)增冠狀病毒屬特異核酸序列。

Target 1（ORF）：

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA；熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGBHQ1-3'。

Target 2（N）：

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。

利用熒光信號實時監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析[4]。患者出院前（即第一階段）病毒核酸檢測陰性包括兩種情況：假陰性和真陰性。從核酸PCR檢測技術(shù)分析，出現(xiàn)假陰性的可能原因包括：①標(biāo)本采集部位不當(dāng)，如采集口咽拭子時，采集深度不夠，未采到鼻腔深處等；②標(biāo)本保存及運送過程不當(dāng)，致使病毒RNA降解；③病毒RNA提取效率低；④核酸檢測靈敏度不夠，低拷貝量病毒核酸不能檢出；⑤部分廠家的試劑產(chǎn)品由于研發(fā)時間短，未使用已知臨床樣本進(jìn)行必要的性能測試，可能存在試劑優(yōu)化不充分以及試劑批間差異大等問題；⑥臨床實驗室的規(guī)范操作、結(jié)果判讀和質(zhì)量控制等。由于以上原因核酸檢測顯示為陰性，但實際上患者體內(nèi)仍然有病毒的存在，如果按照診斷標(biāo)準(zhǔn)出院，就會有傳染的風(fēng)險。此階段核酸檢測為真陰性的可能性是存在的，因為：①經(jīng)過積極抗病毒藥物治療，患者體內(nèi)病毒不再復(fù)制；②患者免疫力發(fā)揮抗病毒作用，通過細(xì)胞免疫或體液免疫清除病毒。真陰性表明患者已治愈，同時無傳染的風(fēng)險。

患者康復(fù)期（即第二階段）核酸檢測陽性同樣包括兩種情況：假陽性及真陽性。出現(xiàn)假陽性的可能原因包括：①標(biāo)本RNA提取過程污染；②PCR擴(kuò)增體系配制過程發(fā)生氣溶膠污染；③盡管實驗過程中應(yīng)用了雙靶標(biāo)特異擴(kuò)增及熒光探針檢測，核酸檢測的特異性得到很大提高，但同其他檢測方法一樣面臨著樣本中非特異干擾的存在[5]；④核酸檢測中用熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物，標(biāo)本中可能由于本底非特異熒光物質(zhì)的干擾而導(dǎo)致熒光信號增強(qiáng)；⑤不同批次檢測試劑、室內(nèi)質(zhì)量控制等也可能是康復(fù)期核酸檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性的原因[6]；⑥由于PCR兩個引物擴(kuò)增的核酸序列為冠狀病毒屬特異序列，并不是SARS-CoV-2的特異序列，因此，可能會檢出同屬其他冠狀病毒的核酸而成為假陽性。根據(jù)流行病學(xué)及臨床特點，中國目前不可能有這些病毒感染，故排除這種假陽性。由上述原因造成的假陽性結(jié)果會導(dǎo)致對康復(fù)期患者做出疾病狀態(tài)的錯誤判斷，增加治療及防護(hù)成本。

類似地，患者康復(fù)期檢測真陽性的原因主要包括：①部分患者免疫功能缺陷或降低，免疫系統(tǒng)不能產(chǎn)生足夠的保護(hù)性抗體，病毒在體內(nèi)增殖而引起復(fù)發(fā)；②第一階段檢測中出現(xiàn)的假陰性結(jié)果在第二階段被正確檢測。這部分真陽性病例體內(nèi)有病毒復(fù)制，存在傳染風(fēng)險。

1.2 康復(fù)期呼吸道纖毛柱狀上皮細(xì)胞排出病毒核酸片段

呼吸道氣管與支氣管管壁組織學(xué)結(jié)構(gòu)相似，由黏膜、黏膜下層和外膜組成。黏膜表面為假復(fù)層纖毛柱狀上皮組織，主要由纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、基細(xì)胞、刷細(xì)胞和彌散的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等組成。纖毛細(xì)胞呈柱狀，每個細(xì)胞游離面約有300根纖毛。纖毛由下呼吸道向上呼吸道方向快速擺動，將呼吸道分泌的黏液物質(zhì)及附于其上的病毒、細(xì)菌及塵粒等異物推向咽部，以咳嗽的方式排出。杯狀細(xì)胞頂部胞質(zhì)內(nèi)含大量黏原顆粒，細(xì)胞分泌的黏蛋白與管壁內(nèi)腺體的分泌物在上皮表面共同構(gòu)成一道黏液性屏障，黏附吸入空氣中的異物?；?xì)胞呈錐形，位于上皮深部，為具有增殖和分化潛能的細(xì)胞，可根據(jù)代謝需求定向分化為纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。SARS-CoV-2進(jìn)入呼吸道后，由于病毒表面特異蛋白與呼吸道上皮細(xì)胞表面受體特異結(jié)合，吸附于上皮細(xì)胞，然后通過穿入、脫殼、生物合成、組裝成熟等環(huán)節(jié)，最后由宿主細(xì)胞釋放大量子代病毒，再感染其他上皮細(xì)胞，導(dǎo)致氣管和支氣管黏膜發(fā)生慢性炎癥病變，出現(xiàn)纖毛細(xì)胞減少，上皮纖毛運動減弱，甚至出現(xiàn)假復(fù)層纖毛柱狀上皮化生為復(fù)層扁平上皮，失去由下呼吸道向上呼吸道逆向擺動排出異物的能力[7]。在COVID-19患者治療過程中，應(yīng)用正壓氧糾正因COVID-19低氧血癥所導(dǎo)致的黏液性物質(zhì)向呼吸道深部聚集現(xiàn)象，同時急性期呼吸道上皮細(xì)胞由于受病毒感染引起嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致堆積在呼吸道被黏液黏附的病毒及核酸片段無法及時排出[8]。這一現(xiàn)象從近日開展的COVID-19患者尸體解剖中肺部切片呈現(xiàn)大量黏液性分泌物得到進(jìn)一步的證實[9]。盡管通過治療及患者自身免疫功能的恢復(fù)，患者臨床癥狀得到有效控制，肺部炎癥改變吸收，但氣管上皮細(xì)胞組織及功能的恢復(fù)需要一定時間，由纖毛逆向擺動至咽部的功能無法發(fā)揮，因此部分滯留在下呼吸道的病毒或病毒核酸片段無法通過咽拭子收集，導(dǎo)致核酸檢測結(jié)果為陰性（假陰性）而達(dá)到出院及解除醫(yī)學(xué)隔離標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)患者處于康復(fù)后期，隨著氣管與支氣管組織結(jié)構(gòu)修復(fù)及功能恢復(fù)，之前滯留于呼吸道的病毒或病毒核酸片段又通過纖毛細(xì)胞的擺動進(jìn)入咽部，咽拭子中檢測到特異核酸片段，故病毒核酸檢測呈陽性（真陽性）。

1.3 分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA，sIgA）結(jié)合病毒康復(fù)期解離

人體經(jīng)呼吸道感染SARS-CoV-2后，抗原提呈細(xì)胞捕獲病毒，并在抗原提呈細(xì)胞內(nèi)加工、處理抗原，將抗原信息提呈B淋巴細(xì)胞，由B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，合成并分泌包括IgA在內(nèi)的多種免疫球蛋白[10]。IgA分為血清型和分泌型兩種，其中sIgA是呼吸道黏膜局部發(fā)揮保護(hù)作用的主要免疫球蛋白。sIgA為雙聚體，每個sIgA分子含兩個單體IgA、一個J鏈和一個分泌片。J鏈通過倒數(shù)第2位二硫鍵將2個IgA單體連接為二聚體，分泌片纏繞在IgA二聚體的結(jié)構(gòu)上使之形成穩(wěn)定連接并不易被酶解的分子，有助于sIgA在黏膜表面保持抗體活性[11]。sIgA性能穩(wěn)定，在局部濃度大，能抑制病原體和有害抗原黏附在黏膜上，阻擋其進(jìn)入體內(nèi)。同時也通過其介導(dǎo)的調(diào)理吞噬和溶解作用，構(gòu)成了黏膜的免疫防御屏障。與其他類型免疫球蛋白相比，IgA鉸鏈區(qū)較短，因此不易被酶解破壞，其半衰期較長（僅次于IgG）[12]。初次受到病毒攻擊后，從抗原提呈到免疫細(xì)胞活化并啟動適應(yīng)性體液免疫應(yīng)答需要較長時間（1～2周），合成并分泌在呼吸道黏膜表面的sIgA通過其抗原結(jié)合片段特異結(jié)合病毒表面抗原，阻止病毒侵入敏感細(xì)胞，病毒由于無法進(jìn)入宿主細(xì)胞而不能完成子代病毒增殖。在COVID-19的發(fā)展及治療過程中，隨著機(jī)體免疫功能的發(fā)揮，早期通過合成干擾素抑制病毒增殖，1周左右合成IgM，2周左右合成IgG，這些免疫球蛋白通過調(diào)理吞噬、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)發(fā)揮抗病毒活性，同時，CD+8 CTL特異殺傷病毒感染細(xì)胞，病毒感染得到有效控制[13]。在藥物的積極治療下，病毒感染引起的組織器官損傷得以控制并逐漸恢復(fù)，臨床癥狀逐漸消退，肺部炎癥吸收，但此時，與sIgA結(jié)合的病毒尚存在于呼吸道黏膜局部，因此，部分患者此時行咽拭子檢測就未能檢測到病毒核酸，出現(xiàn)假陰性。在患者康復(fù)期，由于sIgA被酶解，與之結(jié)合的病毒（可能由于sIgA的作用病毒已失去感染性）或核酸片段釋放出來，通過呼吸道纖毛的擺動排出，這時咽拭子中可能會含有病毒核酸或片段，RT-PCR檢測結(jié)果呈陽性。

2 應(yīng)用其他診斷方法評估康復(fù)期核酸檢測陽性的意義

由于核酸檢測靶點為SARS-CoV-2的2個冠狀病毒屬特異RNA保守序列，其關(guān)注的是病毒核酸片段而不是完整的病毒顆粒，因此，COVID-19患者出院后康復(fù)期即使檢測到病毒特異核酸片段，也無法對標(biāo)本來源者是否發(fā)生感染或具有傳染性做出準(zhǔn)確判斷，有必要結(jié)合其他診斷方法以準(zhǔn)確評估核酸檢測陽性的意義，為診療標(biāo)準(zhǔn)修訂及疫情防控決策提供參考。有鑒于此，其他診斷手段應(yīng)著眼于明確康復(fù)期咽核酸陽性拭子中是否存在具有感染性的完整病毒顆粒。以此為出發(fā)點，可以考慮對康復(fù)期核酸檢測陽性標(biāo)本進(jìn)一步通過病毒培養(yǎng)或雙位點抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法進(jìn)行檢測，綜合實驗結(jié)果進(jìn)行分析。①病毒培養(yǎng)：咽拭子標(biāo)本通過抑菌處理，接種冠狀病毒敏感細(xì)胞株，觀察病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)，并通過電鏡尋找病毒顆粒[14]。②雙位點抗體夾心ELISA：預(yù)制的特異性抗SARSCoV-2S蛋白抗體包被固相載體，加入咽拭子樣品后，再加酶標(biāo)記抗SARS-CoV-2N蛋白抗體，最后加底物顯色，通過酶對底物的分解程度定量檢測病毒抗原含量。前者主要用于判斷核酸檢測陽性標(biāo)本中是否含感染性病毒顆粒，但操作復(fù)雜、需要較長時間；后者操作簡單、省時，可以判斷是否含有病毒抗原。如果病毒培養(yǎng)顯示病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)，提示標(biāo)本來源者呼吸道仍存在完整的具有感染性病毒顆粒，同時具有潛在的傳染風(fēng)險；如無細(xì)胞病變效應(yīng)或ELISA檢測陰性，則表明核酸檢測到的只是SARS-CoV-2核酸片段，標(biāo)本中不含完整具有感染性的病毒顆粒，提示隨訪者無傳染風(fēng)險；而單一雙位點抗體夾心ELISA陽性，只提示標(biāo)本中含有病毒抗原，不能確定標(biāo)本中是否含有感染性病毒顆粒。

3 結(jié)語

綜上所述，由于RT-PCR方法固有的局限性，患者康復(fù)期病毒核酸檢測由陰轉(zhuǎn)陽是一個值得警惕的問題，對COVID-19患者康復(fù)期核酸陽性標(biāo)本進(jìn)行病毒培養(yǎng)或雙抗體夾心ELISA檢測，可以分析康復(fù)期核酸檢測陽性的意義，進(jìn)一步評估其應(yīng)用價值。此外，也可以為后續(xù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》的修訂及疫情管控決策提供重要參考。