蔣棟 康鵬程 肖炯哲 李騰飛 李洵 任煉 成世高 趙會(huì)

作者單位：417000 湖南，南華大學(xué)附屬婁底醫(yī)院、湖南省婁底市中心醫(yī)院骨科 (蔣棟、康鵬程、肖炯哲、李騰飛、李洵、任煉、成世高)；100020 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院骨科 (趙會(huì))

骨肉瘤 (osteosarcoma，OS) 是一種間葉源性的惡性腫瘤，其發(fā)病率占原發(fā)性惡性骨腫瘤的首位[1]。骨肉瘤惡性程度高，預(yù)后差，腫瘤切除聯(lián)合肢體修復(fù)重建術(shù)后患者的 5年生存率為 65%～75%[2]，有轉(zhuǎn)移患者的 5年生存率僅為 20% 左右[3]。目前，對(duì)骨肉瘤發(fā)病機(jī)制及病因?qū)W的研究尚不明確。研究表明，骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展與某些原癌基因的異常激活和抑癌基因的異常失活以及相關(guān)調(diào)控因子的失常密切相關(guān)。

Twist 是一種癌基因[4]，其基因異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且還是上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)變 (epithelial mesenchymal transition，EMT) 過(guò)程中的關(guān)鍵因子，對(duì)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著重要影響[5]。Twist 的表達(dá)水平與腫瘤各亞型的惡性程度密切相關(guān)，浸潤(rùn)性越強(qiáng)表達(dá)越高，惡性程度也越高，增加 Twist 表達(dá)會(huì)提高腫瘤 EMT 能力[6]。目前，僅少量報(bào)道 Twist 在骨肉瘤中存在高表達(dá)，但對(duì) Twist 與骨肉瘤關(guān)系更深入的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，仍有較大的研究空間和研究意義。

E-cadherin 介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附作用的喪失是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要起始步驟，故被認(rèn)為是一種抑癌基因[7]。E-cadherin 表達(dá)下調(diào)、紊亂或缺失都將導(dǎo)致細(xì)胞－細(xì)胞間黏附解體，腫瘤細(xì)胞脫落，侵襲力增強(qiáng)。Twist 可下調(diào) E-cadherin 的表達(dá)誘導(dǎo) EMT 的發(fā)生。

在許多上皮來(lái)源性惡性腫瘤中 Twist 與 E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Twist 高表達(dá)可下調(diào) E-cadherin 表達(dá)，從而促使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差。相反，在 Twist 低表達(dá)腫瘤組織內(nèi) E-cadherin 相對(duì)高表達(dá)，腫瘤細(xì)胞間粘連相對(duì)穩(wěn)定，腫瘤細(xì)胞不易移動(dòng)，患者預(yù)后相對(duì)較好[8-10]。而對(duì)來(lái)源性于間葉組織的骨肉瘤中是否 Twist 的表達(dá)水平與各惡性程度亞型密切相關(guān)；是否 Twist 與 E-cadherin 的表達(dá)在骨肉瘤中呈負(fù)相關(guān)。目前尚未見(jiàn)報(bào)道，需進(jìn)一步研究。

本研究用免疫組化檢測(cè) Twist 及 E-cadherin 在人骨肉瘤、骨軟骨瘤組織中的表達(dá)情況，研究以上兩種基因在不同病理分級(jí)與分型骨肉瘤組織的表達(dá)情況、在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移骨肉瘤組織的表達(dá)情況，并研究 Twist 與 E-cadherin 的相關(guān)性。共同探討 Twist與 E-cadherin 在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)意義，為進(jìn)一步闡明骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、判斷預(yù)后和基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 2012年6月至 2018年11月，婁底市中心醫(yī)院等 4 家三甲醫(yī)院 (婁底市中心醫(yī)院 10例，湘雅二院 13例，岳陽(yáng)市二院 16例，解放軍第 169 中心醫(yī)院 11例) 經(jīng)治的骨肉瘤標(biāo)本；(2) 有明確的病理診斷者；(3)年齡在 5～80 歲之間；(4) 男女均可；(5) 所有患者均接受同一骨肉瘤標(biāo)準(zhǔn)治療方案。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 取標(biāo)本前已經(jīng)大劑量化療等抗腫瘤藥物治療者；(2) 已發(fā)生肺轉(zhuǎn)移等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；(3) 合并其它惡性腫瘤者；(4) 治療前合并嚴(yán)重心肝腎等功能衰竭者；(5) 圍術(shù)期死亡者。

二、研究對(duì)象資料

1. 骨肉瘤組：本研究共納入 4 家醫(yī)院截肢、腫瘤切除或手術(shù)切取活檢的人骨肉瘤標(biāo)本 50例。其中男 36例，女 14例，年齡 6～76 歲，平均 26.14歲；其中股骨 19例，脛骨 12例，肱骨 7例，腓骨6例，上 (下) 頜骨 5例，跟骨 1例。所有標(biāo)本均經(jīng)2 位資深病理科醫(yī)師確認(rèn) (圖 1～6)。

對(duì)所有骨肉瘤標(biāo)本在 HE 染色下按病理組織學(xué)分型為：骨母細(xì)胞型骨肉瘤、軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤、纖維母細(xì)胞型骨肉瘤和混合型骨肉瘤四種[11]。其中含骨母細(xì)胞型骨肉瘤 12例：異型性骨母細(xì)胞為其主要成分，一般伴有豐富的瘤骨形成；軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤 13例：瘤組織中有一半以上呈軟骨肉瘤樣結(jié)構(gòu)，并有化生骨質(zhì)形成，而且有直接形成類骨或瘤骨的梭形瘤細(xì)胞；纖維母細(xì)胞型骨肉瘤 18例：瘤組織中一半以上呈纖維肉瘤樣結(jié)構(gòu)，由束狀及緊密編織狀排列的梭形瘤細(xì)胞組成，但瘤細(xì)胞間可見(jiàn)少量腫瘤性骨質(zhì)或骨樣組織形成；混合型骨肉瘤7例：是指由以上兩種或三種類型等量混合組成，其它特殊類型骨肉瘤也歸為此類。

圖1 骨母細(xì)胞型骨肉瘤 (I 級(jí)) (HE × 400) Fig.1 Osteoblastic osteosarcoma (grade I) (HE × 400)

圖2 軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤 (II 級(jí)) (HE × 400) Fig.2 Chondroblast osteosarcoma (grade II) (HE × 400)

圖3 纖維母細(xì)胞型骨肉瘤 (III 級(jí)) (HE × 400) Fig.3 Fibroblast osteosarcoma (grade III) (HE × 400)

圖4 混合型骨肉瘤 (II 級(jí)) (× 100) Fig.4 Mixed osteosarcoma (grade II) (× 100)

圖5 混合型骨肉瘤 (II 級(jí)) (× 400) Fig.5 Mixed osteosarcoma (grade II) (× 400)

圖6 骨軟骨瘤 (HE × 100) Fig.6 Osteochondroma (HE × 100)

將 50例骨肉瘤根據(jù)瘤細(xì)胞的病理組織學(xué)特征，將其惡性程度分為 I、II、III 級(jí)[12]，其中 I 級(jí)13例：視野中瘤巨細(xì)胞較少，富含骨樣組織，瘤細(xì)胞略呈異型性改變，核分裂相少見(jiàn)，每個(gè)高倍鏡視野僅見(jiàn) 0～1 個(gè)；II 級(jí) 20例：瘤巨細(xì)胞多，中等量骨樣組織，瘤細(xì)胞分化較差，具有一定的異型性，核分裂相較多，每個(gè)高倍鏡視野見(jiàn) 2～3 個(gè)；III 級(jí)17例：瘤巨細(xì)胞較多，僅含少量骨樣組織，瘤細(xì)胞分化差，具有明顯的異型性改變，核分裂相多見(jiàn)，每個(gè)高倍鏡視野見(jiàn) 3 個(gè)以上。

所有骨肉瘤患者術(shù)后經(jīng)電話聯(lián)系和搜索復(fù)查病歷資料隨訪，術(shù)后發(fā)生肺轉(zhuǎn)移等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或術(shù)后2年內(nèi)非其它病因死亡者均歸為轉(zhuǎn)移組，共 29例；術(shù)后未發(fā)生轉(zhuǎn)移且生存期限超過(guò) 2年者另歸非轉(zhuǎn)移組，共 13例；失訪 8例。

2. 骨軟骨瘤組：收集 2012年6月至 2018年11月間婁底市中心醫(yī)院骨科手術(shù)切除的 12例人骨軟骨瘤新鮮標(biāo)本。其中男 6例，女 6例，年齡 3～53 歲，平均 22.08 歲；股骨 6例，脛骨 4例，手指、足趾各 1例。所有標(biāo)本經(jīng)兩位資深病理科醫(yī)師對(duì) HE 切片進(jìn)行復(fù)診確認(rèn)。

三、實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器

兔抗人 Twist (濃縮型) 多克隆抗體 (北京博奧森公司編號(hào)：bs-2441R-AF680)、鼠抗人 E-cadherin(即用型) 單克隆抗體 (福州邁新公司編號(hào)：MAB-0589)、鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶法 (streptavidin-peroxidase，SP) 超敏免疫組化試劑盒 (福州邁新公司編號(hào)：KIT-9720)、石蠟包埋機(jī) (孝感市泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司型號(hào)：BM450B)、病理組織切片機(jī) (英國(guó) SHANDON 公司型號(hào)：AS325)、光學(xué)顯微鏡 (日本 Olympus 公司型號(hào)：BX41)、超清晰度病理圖文分析系統(tǒng) (日本 Olympus 公司型號(hào)：PIPS-2020)。

四、實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)研究中對(duì) Twist 和 E-cadherin 蛋白的表達(dá)均采用 SP 法檢測(cè)。

免疫組織化學(xué)染色 (SP 法) 步驟：(1) 烤片：將烤箱調(diào)至 60 ℃ 烤片 3 h；(2) 脫蠟：二甲苯 I、二甲苯 II 每缸浸泡脫蠟 20 min；(3) 水化：依次經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇 I、II、95%、90%、80%、70% 乙醇各5 min，蒸餾水洗 5 min；(4) PBS 漂洗 5 min×3 次；(5) 微波修復(fù)：pH6.0 檸檬鹽酸緩沖液 (＞500 ml) 置微波盒煮沸，放入切片后中高檔微波修復(fù) 15 min，切片和緩沖液一起自然涼至室溫。PBS 洗 5 min×3 次；(6) 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3% 甲醇-H2O2(SP 試劑盒中試劑 A) 室溫 20 min，PBS 洗 5 min×3 次；(7) 非免疫血清封閉：正常山羊血清 (SP 試劑盒中試劑 B) 封閉，37 ℃ 20 min，甩去余液，不洗；(8) 滴加一抗：滴加一抗 (E-Cad / Twist，預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索 Twist 兔抗人多克隆抗體最適濃度為 1∶200)孵育，濕盒置 4 ℃ 冰箱過(guò)夜；(9) 復(fù)溫 20 min，PBS洗 5 min×3 次；(10) 滴加二抗：滴加二抗 (SP 試劑盒中試劑 C) 孵育，37 ℃ 20 min (二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔 / 鼠 IgG)，PBS 洗 5 min×3 次；(11) 滴加三抗：滴加三抗 (SP 試劑盒中試劑 D) 孵育，37 ℃20 min (三抗為辣根酶標(biāo)記的鏈酶親和素)，PBS 洗5 min×3 次；(12) DAB 顯色：按標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明書配置DAB 顯色液，滴加于切片上，鏡下觀察結(jié)果，控制染色結(jié)果，適時(shí)用蒸餾水沖洗終止；(13) 復(fù)染：置蘇木素中 5 min，自來(lái)水沖洗片刻，75% 的鹽酸酒精溶液分化 30 s，自來(lái)水沖洗 5 min 藍(lán)化；(14) 脫水和透明：依次經(jīng)過(guò) 70%、80%、90%、95%、無(wú)水乙醇，各 5 min，二甲苯 I、II 各透明 10 min；(15) 封片、鏡檢：滴中性樹(shù)脂蓋片，鏡下觀察、記錄并攝片。

五、主要觀察指標(biāo)

Twist 和 E-cadherin 在每個(gè)切片組織中的表達(dá)情況和強(qiáng)度。每張切片均由 2 名資深病理診斷醫(yī)師在雙盲下獨(dú)立觀察。瘤細(xì)胞呈黃色、棕黃色或棕褐色均為陽(yáng)性表達(dá)。

Twist 陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：染色顆粒主要位于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)細(xì)胞核中亦有表達(dá)。在顯微鏡 10×40倍視野下，每張切片隨機(jī)選取 10 個(gè)非重疊視野按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例分為：0%～25% 為弱陽(yáng)性 (+)，25%～50% 陽(yáng)性 (++)，＞50% 為強(qiáng)陽(yáng)性 (+++)。視細(xì)胞未著色或背景均勻一致淡黃色為陰性 (－)。

E-Cad 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性染色顆粒主要位于胞膜和胞質(zhì)中且以胞質(zhì)中為主。在顯微鏡10×40 倍視野下，每張切片隨機(jī)選取 10 個(gè)非重疊視野按陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)部位和所占比例分為：陽(yáng)性：定位于包膜或胞漿者，其中 0%～25% 為弱陽(yáng)性 (+)，25%～50% 陽(yáng)性 (++)，＞50% 為強(qiáng)陽(yáng)性 (+++)；陰性 (－)：細(xì)胞無(wú)著色或背景一致性淡棕色者。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 23.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，運(yùn)用 Chi-square 和 Fisher’s 確切法進(jìn)行χ2檢驗(yàn)比較兩組間的陽(yáng)性率；運(yùn)用成組設(shè)計(jì)兩個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn) (Mann-WhitneyU法) 比較各抗體在骨肉瘤、骨軟骨瘤組織的表達(dá)強(qiáng)度；運(yùn)用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn) (Kruskal-WallisH法) 比較各抗體在骨肉瘤 4 種不同病理組織分型中的陽(yáng)性率；運(yùn)用 Spearman 等級(jí)相關(guān)非參數(shù)檢驗(yàn)，分析 Twist 和E-cadherin 兩者在骨肉瘤中表達(dá)的相關(guān)關(guān)系。以上均以 α＝0.05 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

一、Twist 在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的表達(dá)

Twist 在骨腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性染色部位主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少數(shù)胞核中有表達(dá)，為棕黃色，顯色過(guò)強(qiáng)時(shí)為棕褐色，可見(jiàn)細(xì)小顆粒 (圖 7～12)。

50例骨肉瘤組織和 12例骨軟骨瘤組織中 Twist表達(dá)的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) (表 1，圖 19)。

二、骨肉瘤中 Twist 表達(dá)與其病理分型和分級(jí)的關(guān)系

1. Twist 表達(dá)與病理分型的關(guān)系：在骨肉瘤 4 種不同病理分型中 Twist 表達(dá)的陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05) (表 2，圖 20)。

表1 Twist 在骨肉瘤和骨軟骨瘤組中的表達(dá)情況Tab.1 Expressions of Twist in osteosarcoma and osteochondroma

表2 Twist 在骨肉瘤不同病理組織類型的表達(dá)情況Tab.2 Twist expressions in different osteosarcoma pathological tissues

2. Twist 表達(dá)與病理分級(jí)的關(guān)系：本研究中，將根據(jù)骨肉瘤的惡性程度分為 3 級(jí)，其中把 I 級(jí)列為低級(jí)別骨肉瘤組，把 II、III 級(jí)列為高級(jí)別骨肉瘤組。低級(jí)別與高級(jí)別兩組中 Twist 表達(dá)的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) (表 3，圖 21)。

圖7 Twist 在骨肉瘤中陽(yáng)性表達(dá) (×100) Fig.7 Positive expressions of Twist in osteosarcoma (× 100)

圖8 Twist 在骨肉瘤中陽(yáng)性表達(dá) (× 400) Fig.8 Positive expressions of Twist in osteosarcoma (× 400)

圖9 Twist 在骨肉瘤中陰性表達(dá) (× 400) Fig.9 Negative expressions of Twist in osteosarcoma (× 400)

圖10 Twist 在骨軟骨瘤中陽(yáng)性表達(dá) (× 100) Fig.10 Positive expressions of Twist in osteochondroma (× 100)

表3 Twist 在骨肉瘤低級(jí) (I 級(jí)) 與高級(jí) (II、III 級(jí)) 組的表達(dá)情況Tab.3 Twist expressions of osteosarcoma (grade I; grade II, III)

圖11 Twist 在骨軟骨瘤中陽(yáng)性表達(dá) (× 400) Fig.11 Positive expressions of Twist in osteochondroma (× 400)

圖12 Twist 在骨軟骨瘤中陰性表達(dá) (× 400) Fig.12 Negative expressions of Twist in osteochondroma (× 400)

三、Twist 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)情況

對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所有骨肉瘤患者均經(jīng)術(shù)后隨訪，失訪 8例，全為 Twist 表達(dá)陽(yáng)性。其中轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組兩組 Twist 表達(dá)的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) (表 4，圖 22)。

表4 Twist 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)情況Tab.4 Twist expressions of osteosarcoma metastatic group and nonmetastatic group

四、骨軟骨瘤、骨肉瘤中 E-cadherin 的表達(dá)

E-cadherin 在骨腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性染色部位主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞膜僅少量有表達(dá)，為棕黃色，顯色過(guò)強(qiáng)時(shí)為棕褐色，可見(jiàn)細(xì)小顆粒 (圖 13～18)。

50例骨肉瘤組織與 12例骨軟骨瘤組織兩組E-cadherin 表達(dá)的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) (表 5，圖 19)。

五、骨肉瘤中 E-cadherin 表達(dá)與其病理分型和分級(jí)的關(guān)系

1. E-cadherin 表達(dá)與病理分型的關(guān)系：四組不同病理分型中 E-cadherin 表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05) (表 6，圖 20)。

2. E-cadherin 表達(dá)與病理分級(jí)的關(guān)系：低級(jí)別(I 級(jí)) 組與高級(jí)別 (II、III 級(jí)) 組中 E-cadherin 表達(dá)的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05) (表 7，圖 21)。

六、E-cadherin 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)情況

圖13 E-cadherin 在骨肉瘤中陽(yáng)性表達(dá) (× 100) Fig.13 Positive expressions of E-cadherin in osteosarcoma (× 100)

圖14 E-cadherin 在骨肉瘤中陽(yáng)性表達(dá) (× 400) Fig.14 Positive expressions of E-cadherin in osteosarcoma (× 400)

圖15 E-cadherin 在骨肉瘤中陰性表達(dá) (× 400) Fig.15 Negative expressions of E-cadherin in osteosarcoma (× 400)

圖16 E-cadherin 在骨軟骨瘤中陽(yáng)性表達(dá) (× 100) Fig.16 Positive expressions of E-cadherin in osteochondroma (× 100)

圖17 E-cadherin 在骨軟骨瘤中陽(yáng)性表達(dá) (× 400) Fig.17 Positive expressions of E-cadherin in osteochondroma (× 400)

圖18 E-cadherin 在骨軟骨瘤中陰性表達(dá) (× 400) Fig.18 Negative expressions of E-cadherin in osteochondroma (× 400)

表5 E-cadherin 在骨肉瘤和骨軟骨瘤組中的表達(dá)情況Tab.5 E-cadherin expressions of osteosarcoma and osteochondroma

表6 E-cadherin 在骨肉瘤不同病理組織類型的表達(dá)情況Tab.6 E-cadherin expressions in different osteosarcoma pathological tissues

表7 E-cadherin 在骨肉瘤低級(jí) (I 級(jí)) 與高級(jí) (II、III 級(jí)) 組的表達(dá)情況Tab.7 E-cadherin expressions of osteosarcoma (grade I; grade II, III)

表8 E-cadherin 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)情況Tab.9 E-cadherin expressions of osteosarcoma metastatic group and non-metastatic group

本研究過(guò)程中失訪的8例骨肉瘤組織有 2例E-cadherin 表達(dá)陽(yáng)性，6例陰性。轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中 E-cadherin 表達(dá)的陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05) (表 8，圖 22)。

七、骨肉瘤中 Twist 和 E-cadherin 表達(dá)的相關(guān)性

運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)中的 Spearman 等級(jí)相關(guān)分析骨肉瘤組織中 Twist 和 E-cadherin 表達(dá)強(qiáng)度之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，Twist 和 E-cadherin 表達(dá)強(qiáng)度呈明顯負(fù)相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (rs＝-0.457，P＜0.05) (表 9)。

表9 Twist 和 E-cadherin 在骨肉瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性Tab.9 Correlations between Twist and E-cadherin expressions in osteosarcoma tissues

討 論

骨肉瘤好發(fā)于青少年，惡性程度和致殘率極高。臨床上治療骨肉瘤常采用擴(kuò)大切除或截肢術(shù)，而保肢術(shù)需要聯(lián)合復(fù)雜的修復(fù)重建手術(shù)，治療具有挑戰(zhàn)性。骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展也和其它腫瘤相似，也是一個(gè)由多基因參與、多通路調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。因此，臨床上尋求基因治療骨肉瘤迫在眉睫。

一、Twist 與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

Twist 是一個(gè)可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育細(xì)胞重建并賦予其遷移能力的保守轉(zhuǎn)錄因子。Twist 高表達(dá)可能促進(jìn)細(xì)胞惡性變，是某些惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，特別是與 EMT 及惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

圖19 Twist 與 E-cadherin 在骨肉瘤和骨軟骨瘤中的陽(yáng)性率圖20 Twist 與 E-cadherin 在骨肉瘤不同組織類型中的陽(yáng)性率圖21 Twist 與 E-cadherin 在骨肉瘤低級(jí)和高級(jí)組中的陽(yáng)性率圖22 Twist 與 E-cadherin 在骨肉瘤轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性率Fig.19 Positive rates of Twist and E-cadherin in osteosarcoma and osteochondromaFig.20 Positive rates of Twist and E-cadherin in different osteosarcoma tissuesFig.21 Positive rates of Twist and E-cadherin in the lower and higher groups of osteosarcomaFig.22 Positive rates of Twist and E-cadherin in the metastatic and nonmetastatic groups of osteosarcoma

目前研究顯示，Twist 主要通過(guò)以下作用機(jī)制導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展：(1) Twist 可抑制凋亡程序而激活抗凋亡程序，增強(qiáng)細(xì)胞抗凋亡能力，并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生 EMT[13]。有研究表明 Twist 的凋亡抑制作用也可通過(guò)多種通路抑制抑癌基因 p53 的正常表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。Twist 還可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制分子 p21WAF1 / CIP1 的表達(dá)，增加 p21mRNA 表達(dá)水平，抑制細(xì)胞凋亡[14]。(2) Twist 參與調(diào)節(jié) Wnt 通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化、凋亡及黏附等功能的改變。轉(zhuǎn)錄因子 Twist、APC、Axin 等可在多種人體腫瘤中發(fā)生突變，導(dǎo)致 Wnt 信號(hào)通路的紊亂，使其靶基因的相繼激活及細(xì)胞增生的失控，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的形成[4]。(3) 大量研究顯示 EMT 參與了多種腫瘤脫離原發(fā)灶而發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程，Twist 作為EMT 過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)鍵作用[6]。Twist 與 Snail、SIP1 等其它調(diào)控因子一樣可抑制 E-cadherin 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[15]，Twist 高表達(dá)的細(xì)胞中的 E-cadherin 和 β-catenin 等黏附蛋白表達(dá)降低，從而引起 EMT，其主要機(jī)制是 Twist 能與E-cadherin 啟動(dòng)子區(qū)的 E-box 結(jié)合，抑制 E-cadherin mRNA 的轉(zhuǎn)錄，喪失細(xì)胞間黏附作用，從而促進(jìn)EMT 發(fā)生[16]。另外，Twist 促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)侵襲轉(zhuǎn)移還表現(xiàn)在能促進(jìn)腫瘤血管生成[17]。目前，在多種實(shí)體腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)，Twist 不僅參與了腫瘤的形成，還促進(jìn)了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，惡性程度越高 Twist 表達(dá)也越高。

本研究顯示，Twist 在骨肉瘤組與骨軟骨瘤組表達(dá)陽(yáng)性率比較和表達(dá)強(qiáng)度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。這說(shuō)明 Twist 在骨肉瘤中高表達(dá)，可能是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和分化導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生；Twist 在骨肉瘤各種病理分型中陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，說(shuō)明 Twist 在其病理分型中表達(dá)無(wú)差別；隨著骨肉瘤惡性程度 (即分級(jí)指標(biāo)) 的遞增，Twist 陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度均有上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，說(shuō)明 Twist 陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度可作為判斷骨肉瘤分級(jí)及判斷預(yù)后的指標(biāo)；在隨訪的轉(zhuǎn)移組中 Twist 陽(yáng)性表達(dá)率為 93.10%(27 / 29)，非轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率為 46.15% (6 / 13)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，這提示 Twist 可能參與了骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。

二、E-cadherin 與骨肉瘤的關(guān)系

E-cadherin 屬于上皮型鈣黏附蛋白，為 I 型跨膜糖蛋白，存在于幾乎所有上皮細(xì)胞和部分間質(zhì)細(xì)胞表面[18]，其主要生理功能有：(1) 介導(dǎo)細(xì)胞間連接，是保持細(xì)胞相互黏合的主要細(xì)胞黏附分子；(2)參與細(xì)胞分化和維持機(jī)體組織的結(jié)構(gòu)，必要時(shí)可通過(guò)改變細(xì)胞的微環(huán)境，影響細(xì)胞的分化，參與器官的形成與修復(fù)；(3) 維持原位功能，抑制細(xì)胞遷移，E-cadherin 表達(dá)減少或缺失使瘤細(xì)胞具有移動(dòng)性，使原位腫瘤易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

大量研究表明，E-cadherin 在許多腫瘤組織低表達(dá)，而且惡性程度越高表達(dá)越低。E-cadherin 在正常細(xì)胞及大部分腫瘤細(xì)胞上主要為膜表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)少量表達(dá)。張海燕等[19]研究報(bào)道，E-cadherin 在胃癌組織中卻主要為細(xì)胞質(zhì)及核表達(dá)，包膜上極少表達(dá)，惡性程度越高其表達(dá)量越低。研究顯示，E-cadherin 存在或高表達(dá)的腫瘤其侵襲轉(zhuǎn)移能力較低，是一種腫瘤抑制蛋白，在乳腺癌[20]、肝癌[21]等許多腫瘤中已被發(fā)現(xiàn)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù) E-cadherin 可逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而阻斷 E-cadherin 在惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)又可重新誘發(fā)侵襲轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與其它大部分腫瘤相比，E-cadherin 在骨腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性染色部位主要定位細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞膜僅少量有表達(dá)，其在骨肉瘤組和骨軟骨瘤組中陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。說(shuō)明E-cadherin 的低表達(dá)與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有一定的關(guān)系。

低級(jí)別 (I 級(jí)) 組與高級(jí)別 (II、III 級(jí)) 組中E-cadherin 表達(dá)的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。這說(shuō)明 E-cadherin 與骨肉瘤惡性程度的關(guān)系不大，E-cadherin 尚不能作為評(píng)價(jià)骨肉瘤分級(jí)的指標(biāo)。

E-cadherin 在骨肉瘤各種病理分型中陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，說(shuō)明 E-cadherin 在其病理分型中表達(dá)無(wú)差異；轉(zhuǎn)移組骨肉瘤與非轉(zhuǎn)移組骨肉瘤中 E-cadherin 表達(dá)的陽(yáng)性率比較，非轉(zhuǎn)移組明顯高于轉(zhuǎn)移組 (P＜0.05)。這提示 E-cadherin 低表達(dá)也可能參與了骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。

三、骨肉瘤中 Twist 與 E-cadherin 之間的關(guān)系

大量研究表明，Twist 與 E-cadherin 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起非常關(guān)鍵的作用，且分別通過(guò)多種通路導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前，在研究腫瘤中 Twist 與E-cadherin 關(guān)系的焦點(diǎn)通路為 EMT，Twist 可以與E-cadherin 啟動(dòng)子區(qū)的 E-box 結(jié)合，抑制 E-cadherin mRNA 的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)由 E-cadherin 介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附消失，并使上皮細(xì)胞發(fā)生 EMT 轉(zhuǎn)化。有研究報(bào)道，通過(guò)阻止骨肉瘤細(xì)胞 Wnt / LRP5 信號(hào)通路可明顯上調(diào) E-cadherin 表達(dá)，并且可明顯降低 Twist 介導(dǎo)的侵襲轉(zhuǎn)移能力[23]。但在骨肉瘤組織中 Twist 下調(diào) E-cadherin 表達(dá)的作用機(jī)制尚不明確，Twist 是否還存在另外的通路導(dǎo)致 EMT、促進(jìn)瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移尚不清楚。

本研究運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)中的 Spearman 等級(jí)相關(guān)分析骨肉瘤組織中 Twist 和 E-cadherin 表達(dá)強(qiáng)度之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，Twist 和 E-cadherin 表達(dá)強(qiáng)度之間呈明顯負(fù)相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (rs＝-0.457，P＜0.05)，這說(shuō)明 Twist 在骨肉瘤中高表達(dá)可能抑制 E-cadherin 的表達(dá)，EMT 可能也參與了骨肉瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)外絕大多數(shù)研究表明 EMT 主要是上皮性來(lái)源腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，而在間葉源性的骨肉瘤中 Twist 與 E-cadherin 是否還通過(guò)另外的途徑導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移尚需進(jìn)一步研究探討。