黃 倩， 李京濤， 劉永剛， 魏海梁， 閆曙光， 郭英君， 常占杰

1 陜西中醫(yī)藥大學 a.第一臨床醫(yī)學院； b.基礎醫(yī)學院， 陜西 咸陽 712406； 2 陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院a.肝病一科； b.普外一科， 陜西 咸陽 712406； 3 寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 感染疾病科， 銀川 750001

郭英君，電子信箱：510410652@qq.com

肝臟是人體最大的實性臟器，在營養(yǎng)物質的儲存代謝、新分子的合成和有毒化學物質轉化等多種生理過程中起著關鍵作用[1]。肝炎病毒、某些藥物和酒精等是引起肝損傷的常見因素，嚴重者出現(xiàn)肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。自噬是一個溶酶體降解的過程，調節(jié)細胞器和蛋白質的穩(wěn)態(tài)。一方面，自噬調節(jié)肝臟生理和平衡肝臟代謝，通過消除肝臟疾病中出現(xiàn)的受損細胞器和蛋白質，保護肝細胞免受損傷和死亡；另一方面，自噬促進肝損傷的進一步惡化(如過度自噬可導致肝細胞自噬性死亡；增加肝星狀細胞自噬可促進其活化，加重肝纖維化)[2]。因此，自噬的正確調節(jié)對肝損傷的治療意義毋庸置疑。研究[3]發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種保守的代謝傳感器，其作用靶點能有效調節(jié)自噬，mTOR通過調節(jié)自噬相關蛋白(autophagy-related proteins，ATG)和溶酶體生物合成，在自噬過程中起著負調節(jié)作用。mTOR受多種不同的上游信號通路的影響，這些信號通路可以通過調節(jié)mTOR相應地抑制或增強自噬水平。本文主要論述磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)上游途徑介導的mTOR自噬在不同肝損傷中的作用，以期通過調節(jié)自噬為肝損傷的治療提供新的靶點。

1 自噬的分類及過程

自噬是細胞通過自身降解和代謝產(chǎn)生的一種“自我進食”的過程,分為非選擇性自噬和選擇性自噬。非選擇性自噬用于饑餓條件下的體細胞漿周轉，而選擇性自噬主要針對受損或過量的細胞器，包括受損的線粒體、不需要的過氧化物酶體、過量的核糖體和脂滴，以及侵襲性微生物[4]。根據(jù)細胞物質運到溶酶體內的途徑不同，自噬可分為巨自噬、微自噬和伴侶介導自噬。通常所說的自噬是指巨自噬(以下簡稱自噬)。mTOR和AMPK是自噬的主要調控因子， mTOR為抑制因子，AMPK為激活因子。自噬的不同步驟受到對應的ATG的調控。自噬的過程分為5個連續(xù)的步驟：分隔膜的形成、分隔膜的延伸、自噬體的形成、自噬溶酶體的形成、自噬溶酶體的降解。正常條件下，細胞自噬水平普遍較低，當受到缺氧、氧化應激、蛋白質聚集、內質網(wǎng)應激等刺激時，會進一步誘導自噬。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，當自噬體與溶酶體融合時，位于自噬體內膜上的微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associatedprotein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)在自溶體內降解，而位于自溶體細胞質面上的LC3-Ⅱ被ATG4破壞并再循環(huán)。降解后生成的氨基酸、脂類和碳水化合物通過轉運蛋白和滲透酶到達細胞質，實現(xiàn)了細胞內物質的循環(huán)利用[5]。

2 mTOR概述

2.1 mTOR結構和對自噬的調節(jié) mTOR是PI3K相關激酶家族中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由2549個氨基酸組成，包含多個功能域和調節(jié)域。mTOR包括兩個不同的信號復合物：mTOR復合物1(mTORC1)和mTOR復合物2(mTORC2)。mTORC1是細胞分解代謝和自噬的關鍵調節(jié)因子，對自噬具有負性調節(jié)作用，但其調節(jié)自噬的機制復雜，自噬相關蛋白的調節(jié)和溶酶體的生物合成是整個過程的關鍵。mTORC1至少以4種方式[6-8]調節(jié)自噬。其一，mTORC1在Ser758處磷酸化unc-51樣自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)，防止ULK1和AMPK之間的相互作用，從而抑制ULK1活性。AMPK是調節(jié)自噬所必需的，在葡萄糖缺乏期間，AMPK在Ser317/Ser777處磷酸化ULK1并將其激活。其二，mTORC1也直接磷酸化ATG13以抑制ULK復合物的活性，而ATG13中的mTORC1磷酸化位點仍有待確定。mTORC1通過直接磷酸化自噬/芐氯素1調節(jié)因子1抑制自噬，其促進Beclin-1與脂質激酶VPS34的相互作用，從而促進自噬體的成核。其三，mTORC1通過在多個位點(Ser3、Ser223、Thr233、Ser383和Ser440)直接磷酸化Ⅲ類PI3K復合物中的ATG14來抑制自噬。ATG14的磷酸化抑制相關激酶VPS34產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3-磷酸，幫助自噬體的形成。其四，mTORC1通過調節(jié)溶酶體形成所需基因的轉錄間接抑制自噬。轉錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)是溶酶體發(fā)生和自噬基因的主要轉錄調節(jié)因子。TFEB促進編碼溶酶體發(fā)生和自噬所需蛋白質的基因轉錄，從而間接激活自噬。mTORC1直接磷酸化TFEB的Ser142和Ser211位點，將其保留在細胞質中以抑制自噬[9]。研究[10]表明mTORC2可能通過激活mTORC1間接抑制自噬，mTORC2可以磷酸化疏水基序位點Ser473處的AKT，激活AKT/mTORC1信號軸。但mTORC2能否直接調節(jié)自噬還有待進一步研究。

2.2 mTOR在肝臟代謝和肝病中的作用 肝臟作為人體重要的代謝器官，在調節(jié)酮類、脂質代謝、血糖和胰島素穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關鍵作用，mTOR在這些過程中扮演著重要角色[11]。肝臟在人體禁食后會調動多種功能來維持系統(tǒng)平衡，包括增加酮體的產(chǎn)生，為周圍組織提供能量。Sengupta等[12]發(fā)現(xiàn)mTORC1在肝特異性TSC1缺失小鼠的肝臟中被激活，導致禁食期間酮體生成和生酮基因表達明顯缺陷，提示mTORC1能抑制禁食小鼠的酮生成。研究[13]發(fā)現(xiàn)轉錄因子SREBP的激活促進脂肪生成，在肝臟中，mTORC1通過兩條獨立的途徑上調SREBP的表達。一種是S6K1依賴性方式，介導SREBP-1的成熟。另一種在營養(yǎng)素和生長因子的作用下，mTORC1直接磷酸化mTORC1底物磷脂酸磷酸酶lipin-1(SREBP-1活性的負調節(jié)因子)，防止脂質移位進入細胞核，從而使SREBP轉錄活躍，促進脂質合成[14]。在L-TSC1-KO小鼠中，mTORC1信號的慢性激活對胰島素受體底物1產(chǎn)生強烈的抑制性反饋，導致AKT信號減少，葡萄糖不耐受。mTORC2也能維持脂質和葡萄糖平衡[15]，肝臟特異性基因敲除物Ricto(mTORC2的核心成分)小鼠表現(xiàn)出低血脂和高血糖[16]。此外，mTOR介導的自噬能減輕肝損傷。在肝缺血再灌注損傷中，mTOR介導的肝細胞自噬激活可促進肝細胞存活，抑制肝細胞凋亡，從而修復肝缺血再灌注損傷[17]。在肝癌中，抑制mTOR介導的肝癌細胞保護性自噬可以加速肝癌細胞的死亡，緩解肝癌的惡性發(fā)展[18]。

3 自噬通過靶向PI3K/AKT/mTOR途徑對肝損傷的影響

自噬的失調可以導致多種肝臟疾病，正確調節(jié)自噬是治療肝損傷的關鍵。mTOR的主要靶點是調節(jié)自噬的核心中樞，通過調節(jié)mTOR介導的自噬，有望找到基于自噬治療人類肝病的新靶點。

PI3K/AKT信號通路參與細胞增殖、凋亡、自噬等多種功能的調節(jié)。PI3K是細胞內脂質激酶家族的成員，磷酸化30個磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇的羥基。根據(jù)結構、功能和底物的不同，PI3K可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4類，Ⅰ類PI3K在調節(jié)細胞生長和存活方面起關鍵作用[19]，故主要討論Ⅰ類PI3K。Ⅰ類PI3K分為ⅠA類PI3K和ⅠB類PI3K。ⅠA類PI3K是由調節(jié)亞基 P85和催化亞基 P110構成的異二聚體，由受體酪氨酸激酶激活。ⅠB類PI3K被G蛋白偶聯(lián)受體激活，由催化亞單位p110γ和調節(jié)亞單位p101或其同系物p84和p87PIKAP(87 kD的PI3Kγ銜接蛋白)的異二聚體組成。當細胞受到刺激時，ⅠB類PI3K的調節(jié)亞基直接與三聚體G蛋白的Gβγ亞基相互作用，激活ⅠB類PI3K的催化亞基[20-21]。AKT屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，由AKT1、AKT2和AKT3三個亞單位組成。AKT2在肝細胞中的表達最多，占肝臟AKT的85%。AKT是PI3K的一個關鍵下游靶點，通過磷酸化參與細胞生存、增殖和代謝而發(fā)揮多種下游效應[22]。AKT的Ser473和Thr308的氨基酸殘基分別被mTORC2復合物和蛋白PDK1磷酸化以完成激活。PI3K/AKT信號通路在肝損傷中起關鍵作用。研究[23]表明一氧化碳預處理可通過誘導肝內PI3K/AKT通路的激活，抑制AKT下游底物GSK3β的活性，從而降低炎癥因子的表達，增強抗炎能力，降低肝細胞損傷程度。低溫預處理可以通過激活PI3K/AKT/FoxO3a途徑抑制細胞凋亡和炎癥損傷，提供保護肝臟的有效手段[24]。除了GSK3和FoxO轉錄因子外，mTOR也是AKT的關鍵下游信號節(jié)點。AKT激活mTORC1的主要機制是通過直接磷酸化和抑制TSC2(mTORC1的有效抑制劑)，從而間接激活了mTORC1[25]。此外，AKT還可以通過磷酸化和抑制PRAS40(一種負調控復合物激酶活性的mTORC1成分)直接激活mTORC1以抑制自噬[26]。Mammucari等[27]發(fā)現(xiàn)饑餓小鼠骨骼肌中mTOR2的抑制導致自噬的誘導，該自噬由AKT負調控的下游靶向FoxO3轉錄因子介導，提示mTORC2也可能負性調節(jié)自噬。如上所述，PI3K/AKT信號通路是mTOR的上游調控因子，通過激活PI3K/AKT/mTOR介導的自噬能有效改善或逆轉肝損傷。

3.1 慢性乙型肝炎 HBV是一種帶有圓環(huán)的小DNA病毒，如果抑制不佳，可通過慢性感染肝細胞而出現(xiàn)“肝炎-肝硬化-肝癌”三部曲[28]。據(jù)報道[29]，全世界約有3.5億人感染HBV，因此HBV影響宿主細胞促進病毒復制的機制一直是研究的熱點。新近研究[30]表明自噬與HBV的復制有關，microRNA-99家族成員可通過直接靶向其mRNAs降低胰島素樣生長因子1受體(recombinant insulin like growth factor 1 receptor，IGF-1R)、AKT和mTOR的總水平及磷酸化水平，然后進行ULK1去磷酸化，導致自噬體的形成，從而誘導自噬促進HBV的復制，自噬促進HBV的復制是microRNA-99家族通過IGF-1R/PI3K/ AKT/mTOR/ULK1信號通路誘導的。Wang等[31]發(fā)現(xiàn)HBx轉染HepG-2細胞(一種廣泛應用的人肝癌細胞)后，通過PI3K/AKT/mTOR途徑顯著提高了其自噬水平，表明增加腫瘤細胞的自噬可以提高其抗應激能力，促進腫瘤細胞的存活。因此，PI3K/AKT/mTOR介導的自噬可能是HBV感染后肝癌發(fā)生的重要機制，抑制PI3K/AKT/mTOR介導的自噬可能是治療慢性HBV感染的新靶點。

3.2 肝纖維化 PI3K/Akt/mTOR是肝纖維化形成過程中重要的信號通路之一，該通路通過調控肝星狀細胞(HSC)的增殖和凋亡在肝纖維化的形成過程中發(fā)揮著重要作用。肝纖維化是慢性肝損傷的重要病理生理后果，其主要特點是細胞外基質(ECM)不斷積累，瘢痕組織的形成導致肝實質破壞。纖維化最終會導致器官衰竭，預防纖維化疾病取決于清除過多ECM的能力，而HSC是ECM的主要來源，因此，HSC的激活是肝纖維化發(fā)展的關鍵因素[32]。自噬在肝纖維化中起著雙重作用。一方面，細胞自噬可以通過激活HSC進而促進肝纖維化的發(fā)生；另一方面，細胞自噬通過保護肝細胞減少ECM的產(chǎn)生，進而通過有效降解異常突變蛋白表達水平有效減緩肝纖維化進展[33]。HSC中自噬的增加可以通過降解脂滴來激活HSC，從而提供能量[34]。例如，研究[35]發(fā)現(xiàn)IGFBPrP1通過促進PI3K/AKT/mTOR信號途徑介導的自噬而促進HSC的激活。但另一項研究[36]通過用不同濃度的甲基螺旋體(methyl helicterate,MH)處理HSC-T6細胞，發(fā)現(xiàn)MH抑制HSC的活化，顯著提高HSC的自噬水平，當使用自噬抑制劑3-MA或ATG5敲除來抑制HSC-T6細胞的自噬時，MH抑制HSC-T6細胞活化的能力減弱。mTOR誘導HSC-T6細胞自噬可增加HSC-T6細胞凋亡，提示HSC自噬的增加抑制了HSC的活化，PI3K/AKT/mTOR通路是MH誘導HSC自噬的主要機制。Lee等[37]發(fā)現(xiàn)天然化合物蘆丁和姜黃素通過調節(jié)PI3K/AKT/mTOR途徑刺激脂肪酸誘導的NHSC自噬(非化學誘導的HSC)，NHSC的活化受到抑制。李碩熙等[38]研究發(fā)現(xiàn)芪參湯通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化，進而抑制肝組織中膠原沉積，減緩纖維化進展。以上結果提示PI3K/AKT/mTOR介導的自噬在逆轉肝纖維化中的重要作用，但其雙向調節(jié)作用的原因尚不清楚，可能是由于PI3K/AKT/mTOR通路在HSC活化中的特殊作用，或是HSC自噬活化的程度不同：HSC自噬的適度活化可以為HSC的活化提供能量，HSC自噬的過度活化可能引起HSC自噬細胞死亡，從而抑制HSC的活化。

3.3 肝癌 肝癌是一種高度惡性和致死率高的腫瘤。自噬和PI3K/AKT/mTOR途徑在腫瘤發(fā)生和治療中起著重要的調控作用，是許多抗癌藥物的治療靶點。自噬在肝癌發(fā)展的不同階段起著雙重作用。一方面，自噬可以通過去除正常細胞中受損的細胞器和特定蛋白質來防止腫瘤轉化，改善癌細胞的炎癥反應和基因組不穩(wěn)定性，發(fā)揮抑癌作用。另一方面，適當?shù)淖允煽梢酝ㄟ^滿足腫瘤細胞的代謝需求促進腫瘤細胞的生存和惡性行為，加劇腫瘤的惡化[39]。因此，平衡自噬活性在癌癥治療中的意義非凡。目前，自噬抑制劑氯喹和羥基氯喹或自噬誘導劑雷帕霉素及其同系物在肝癌發(fā)展的不同階段都能發(fā)揮相應的自噬調節(jié)作用[40]。有研究[32]報道，許多癌細胞異常激活AKT和PI3K，導致mTOR激活，mTOR通過磷酸化下游p70S6K和4EBP1來激活蛋白質合成，調節(jié)癌細胞增殖。一些中藥如姜黃素和青藤堿通過阻斷PI3K/AKT/mTOR途徑發(fā)揮重要的抗癌作用[41]。但是當PI3K/AKT/mTOR途徑被抑制時，其下游的關鍵自噬被激活，成熟癌細胞自噬激活促進惡性行為，與PI3K/AKT/mTOR途徑對癌細胞的抑制作用相矛盾，提示自噬抑制劑與PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑的聯(lián)合應用在腫瘤治療中具有重要意義。例如，芹菜素可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR途徑抑制肝癌細胞增殖并誘導自噬，Yang等[42]發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑與芹菜素聯(lián)合應用更為有效。但Ye等[43]發(fā)現(xiàn)通過抑制PI3K/AKT/mTOR途徑激活肝癌細胞自噬，能有效誘導肝癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖及腫瘤的侵襲和遷移，結果表明自噬的激活并不促進肝癌細胞的惡性行為，其主要原因可能是通過PI3K/AKT/mTOR途徑過度激活肝癌細胞自噬，從而導致肝癌細胞自噬性死亡(又稱程序性細胞死亡Ⅱ型)。自噬在腫瘤發(fā)生中的作用一直存在爭議，故而今后的研究應更多地關注PI3K/AKT/mTOR介導的自噬在肝癌不同發(fā)展階段的作用，為PI3K/AKT/mTOR介導的自噬治療肝癌提供更可靠的依據(jù)。

3.4 非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 非酒精性脂肪肝(NAFLD)是世界上最常見的慢性肝病，隨著人們生活水平的提高，其發(fā)病率逐年攀升。NAFLD包括從單純性脂肪變性到NASH、肝纖維化、肝硬化等一系列組織學異常改變[44-45]。NASH是包括胰島素抵抗、氧化應激、自噬受損、脂肪毒性和腸源性脂多糖(LPS)等多種因素聯(lián)合作用的結果。自噬通量受損，導致p62和泛素化蛋白聚集是NASH的共同特征。肝細胞中p62包涵體的形成是區(qū)分NASH和單純性脂肪肝的一個重要標志，是預測肝癌發(fā)生的重要指標[46-47]。研究[48]發(fā)現(xiàn)東莨菪堿能改善甲硫氨酸膽堿缺乏誘導的NASH小鼠肝臟自噬通量的損傷和p62的積累。東莨菪堿通過LPS激活的RAW264.7細胞(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞)來阻斷PI3K/AKT/mTOR通路，增強巨噬細胞(而非肝細胞)的自噬功能，改善小鼠自噬和NASH相關的炎癥反應，減少p62和LC3的積累。在RAW264.7細胞中，東莨菪堿降低了LPS誘導的自噬體和自噬底物的積累、活性氧的產(chǎn)生和炎癥反應，加速LPS誘導的RAW264.7細胞自溶體的形成,改善NASH的幾個關鍵特征(包括血清ALT和AST水平升高、肝組織學改變和促炎癥基因的表達)，且無明顯副作用。研究[49]顯示AKT激活劑SC79能激活mTOR并抑制自噬，但對炎癥沒有顯著影響，這可能是PI3K/AKT信號通路多重作用的結果。綜上在LPS誘導的RAW264.7細胞中，東莨菪堿通過增加自熔體形成和負性調節(jié)PI3K/AKT/mTOR途徑，加速自噬通量，促進自噬體降解，有望成為治療NASH或與巨噬細胞自噬失調相關疾病的新型藥物。

4 小結

在自噬調節(jié)肝損傷的過程中，mTOR相關上游途徑PI3K/AKT介導的自噬參與了不同肝損傷的發(fā)展和轉歸，調控PI3K/AKT/mTOR信號通路介導自噬的相關研究與探索為防治肝臟疾病提供了一些新思路和途徑，研究表明相關藥物可以通過mTOR上游途徑介導自噬治療肝損傷，但藥物對該途徑的哪一部分的調節(jié)尚不清楚。因此，下一步的研究焦點應在探討藥物靶向PI3K/AKT/mTOR通路的具體機制上進行更深入研究。

作者貢獻聲明：黃倩負責閱讀,分析文獻，收集數(shù)據(jù)及撰寫論文；閆曙光、魏海梁、郭英君負責修改論文；李京濤、劉永剛、常占杰負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。